FGFR2在顱骨缺損修復(fù)和骨形成中的作用研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors,FGFs)及其受體(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用,其功能增強(qiáng)型突變可導(dǎo)致包括軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia,ACH)、顱縫早閉(craniosynostosis,CS)等在內(nèi)的多種人類骨骼遺傳病。FGFRs屬于酪氨酸激酶受體家族,目前發(fā)現(xiàn)有4個(gè)成員,均由胞外的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)

2、和胞內(nèi)高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)三部分構(gòu)成。類似其它酪氨酸激酶受體,FGFRs在與配體FGFs結(jié)合后,發(fā)生二聚化反應(yīng)激活FGFRs胞內(nèi)段的酪氨酸激酶活性,從而經(jīng)Ras-MAPK、PI3K-AKT及PLC-γ等通路向下游傳遞信號(hào),發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　FGFR2是FGFRs家族參與骨骼發(fā)育過(guò)程的重要成員,主要在顱縫成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞及長(zhǎng)骨骨膜中表達(dá)。FGFR2兩種功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變(S252W、P253R)可引起Apert綜合征,表現(xiàn)為

3、冠狀縫早閉、短頭畸形、顱面發(fā)育不良并伴嚴(yán)重的并指。FGFR2跨膜區(qū)功能降低型突變則引起B(yǎng)BD綜合征(Bent Bone Dysplasia,BBD),患者表現(xiàn)為顱縫早閉、面部發(fā)育畸形及長(zhǎng)骨彎曲。Fgfr2敲除小鼠在胚胎期10.5天死亡,出現(xiàn)包括顱骨和肢體(limb)在內(nèi)的多個(gè)器官發(fā)育障礙。間質(zhì)細(xì)胞條件敲除 Fgfr2小鼠表現(xiàn)為頭顱畸形、體型矮小、生長(zhǎng)遲緩、骨密度下降。上述結(jié)果提示FGFR2在骨骼發(fā)育特別是顱骨發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

4、>　　顱骨缺損后再生修復(fù)在一定程度上是局部顱骨的再發(fā)育過(guò)程,多種調(diào)控骨骼發(fā)育的分子如Wnts、FGFs、BMPs等都參與顱骨缺損后再生修復(fù)過(guò)程。鑒于FGFR2在骨骼發(fā)育特別是顱骨發(fā)育中的重要作用,FGFR2可能參與了顱骨缺損后的再生修復(fù)過(guò)程,但其具體作用及詳細(xì)機(jī)制不清。為了探索FGFR2在其中的作用及相關(guān)機(jī)制,我們基于CreER(T2)-Loxp系統(tǒng)建立了成年期FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠,在排除早期發(fā)育對(duì)成骨影響的基礎(chǔ)上,通過(guò)

5、建立顱骨缺損模型觀察FGFR2對(duì)顱骨損傷修復(fù)的影響并探討其可能的機(jī)制。
　　機(jī)械性骨髓消融(Mechanical bone marrow ablation,BMX)可引起損傷后骨髓腔內(nèi)膜內(nèi)成骨過(guò)程,可較好的用于研究基因在骨形成和骨重建中的作用。因 BMX后的骨形成和顱骨缺損后的骨再生過(guò)程均為膜內(nèi)成骨過(guò)程,我們進(jìn)一步在第二部分利用BMX模型,研究FGFR2對(duì)骨形成的影響,可從另一側(cè)面驗(yàn)證FGFR2在顱骨缺損修復(fù)中的作用。
　　

6、方法:
　　第一部分:FGFR2在顱骨缺損修復(fù)中的作用和機(jī)制研究
　　1.建立FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠顱骨缺損模型;
　　2.利用 Micro-CT實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察顱骨缺損后2周、4周、8周缺損愈合過(guò)程,并定量測(cè)量缺損愈合面積;利用X線攝片觀察顱骨缺損后8周缺損愈合情況;
　　3.組織病理 H.E染色觀察顱骨缺損后8周缺損邊緣骨形成情況;
　　4.定量PCR檢測(cè)顱骨缺損后兩周顱骨成骨分化相關(guān)基因Ru

7、nx2、ColI、OP、OC的表達(dá)變化;
　　5.FGFR2P253Rneo/+;EIIa-Cre小鼠顱骨成骨細(xì)胞分離培養(yǎng),細(xì)胞計(jì)數(shù)及 MTT測(cè)定增殖情況;FGFR2P253Rneo/+;CMV-CreER(T2)成骨細(xì)胞4-羥基他莫昔芬處理后,經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化,通過(guò)ALP染色和定量PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI、OP、OC的表達(dá)觀察成骨分化情況;Western Blot檢測(cè)磷酸化ERK1/2蛋白水平變化;
　

8、　6.定量 PCR檢測(cè)成骨誘導(dǎo)14天后經(jīng)典 Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因 Dvl2、β-catenin、Tcf-1的表達(dá)。
　　第二部分:FGFR2功能增強(qiáng)對(duì)BMX后骨形成的影響
　　1.通過(guò)X線攝片和Micro-CT觀察BMX后1周和2周骨形成情況;
　　2.通過(guò)H.E染色和成骨細(xì)胞形態(tài)計(jì)量觀察BMX后1周和2周成骨細(xì)胞的功能活性;
　　3.定量PCR檢測(cè)BMX后2周成骨分化相關(guān)基因Runx2、Col

9、I、OP、OC的表達(dá);
　　4.通過(guò)TRAP染色和破骨細(xì)胞形態(tài)計(jì)量觀察BMX后1周和2周破骨細(xì)胞的功能活性;
　　5.定量PCR檢測(cè)BMX后2周TRAP、CTSK、RANKL、OPG表達(dá)及RANKL/OPG的比值。
　　結(jié)果:
　　一、FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠顱骨缺損愈合加快,成骨能力增強(qiáng)
　　1.Micro-CT掃描顯示顱骨缺損后2周、4周、8周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠缺損未愈合

10、面積較野生小鼠減少,定量測(cè)量顯示顱骨缺損后8周 FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠缺損愈合百分比明顯高于野生小鼠;H.E染色顯示顱骨缺損后8周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠缺損邊緣新生骨組織較野生小鼠多;
　　2.定量PCR結(jié)果顯示顱骨缺損后2周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠缺損周圍骨組織Runx2、ColI、OP、OC的表達(dá)較野生小鼠高;
　　3.FGFR2P253R/+功能增強(qiáng)顱骨成骨細(xì)胞增殖加快、分化增

11、強(qiáng);
　　(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)及 MTT檢測(cè)提示 FGFR2P253R/+功能增強(qiáng)顱骨成骨細(xì)胞增殖加快;經(jīng)成骨誘導(dǎo)后ALP活性增加,成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI、OP表達(dá)上調(diào)。
　　(2)FGFR2P253R/+功能增強(qiáng)顱骨成骨細(xì)胞磷酸化ERK1/2蛋白水平升高。
　　(3)FGFR2P253R/+功能增強(qiáng)顱骨成骨細(xì)胞經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Dvl2、Tcf1表達(dá)上調(diào),β-catenin表達(dá)不變。

12、r>　　二、FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠BMX后骨形成增加、骨吸收過(guò)程延遲。
　　1.X線和Micro-CT掃描顯示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠骨形成增加。
　　2.H.E染色和成骨細(xì)胞形態(tài)計(jì)量顯示BMX后1周和2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠新生骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)增加,定量PCR結(jié)果顯示BMX后2周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠新生骨組織中成骨分化相關(guān)基因Runx2、ColI

13、、OC表達(dá)上調(diào)。
　　3.TRAP染色和破骨細(xì)胞形態(tài)計(jì)量顯示BMX后1周FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠破骨細(xì)胞活性較野生小鼠低,而BMX后2周,FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠破骨細(xì)胞活性卻較野生小鼠高;同時(shí)野生小鼠破骨細(xì)胞活性在BMX后1周較高,第2周明顯降低,相反, FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠破骨細(xì)胞活性在 BMX后2周較高,提示FGFR2P253R/+誘導(dǎo)增強(qiáng)小鼠BMX后骨吸收過(guò)程延遲。
　　結(jié)論:

14、
　　1.FGFR2功能增強(qiáng)促進(jìn)小鼠顱骨缺損的愈合和成骨活性;
　　2.FGFR2功能增強(qiáng)促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞的增殖;FGFR2功能增強(qiáng)促進(jìn)了Runx2的表達(dá),繼而上調(diào) ColI、OP的表達(dá)促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞的分化;這一作用可能部分通過(guò)激活ERK1/2 MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的;
　　3.FGFR2功能增強(qiáng)可能通過(guò)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化;
　　4.FGFR2功能增強(qiáng)促進(jìn)BMX后的骨形成,