致密層在骨軟骨復合支架修復兔關節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、疾病等原因,常常導致關節(jié)軟骨的缺損,易發(fā)展為骨性關節(jié)炎(osteoarthritis OA),給患者帶來巨大的痛苦。關節(jié)軟骨無血液供應,加之軟骨細胞為分裂、增殖和代謝不活躍的穩(wěn)定細胞,因而其自身修復能力極差。此外,關節(jié)軟骨全層缺損后,位于其下的軟骨下骨往往會出現(xiàn)退變、硬化等病理改變,而新生軟骨是無法與硬化、退變的軟骨下骨進行整合的,故關節(jié)軟骨缺損的修復必須考慮同時修復病變的軟骨下骨。到目前為止,臨床上采用的多種外科治療方法,均

2、未能獲得滿意的治療效果。組織工程技術的進步,給關節(jié)骨軟骨損傷的修復再來希望。近十年來,已有部分學者使用骨支架與軟骨支架的復合體,來修復關節(jié)骨軟骨損傷。雖然獲得了部分成功,但仍有兩大問題制約其在臨床上推廣:一,軟骨支架與骨支架之間的結合力差,在關節(jié)內(nèi)不能承受各種應力,經(jīng)常發(fā)生斷裂現(xiàn)象;二,骨軟骨復合支架上的種子細胞的增殖、分化能力差,骨軟骨組織的修復情況不佳。
　　要解決以上兩大問題,必須要對骨軟骨的組織結構和細胞的生存環(huán)境有個充分

3、的理解。正常關節(jié)面由軟骨和軟骨下骨構成。在微觀結構上,軟骨分四層:淺表層、移行層、柱狀層和鈣化層。鈣化層結構致密,實質上是軟骨與軟骨下骨的過渡層,起著隔離軟骨和軟骨下骨的作用,同時將二者牢固地整合在一起。軟骨營養(yǎng)主要來源于關節(jié)腔滑液,而關節(jié)液中的氧濃度明顯低于軟骨下松質骨的氧供濃度。軟骨細胞適應低氧環(huán)境,低氧條件下有利于軟骨細胞的分化、增殖。如果血液一旦侵入關節(jié)腔內(nèi),其中一些成分會因觸發(fā)炎性反應而導致新生軟骨細胞凋亡或壞死。與此同時,如

4、果關節(jié)液滲透入軟骨下骨,亦有害于成骨細胞,嚴重影響其活性。由此可見,尤其對于修復能力差的軟骨細胞來說,鈣化層是維持其良好狀態(tài)必不可少的條件。理想的骨軟骨組織工程支架應模擬正常關節(jié)的骨軟骨結構,在復合骨軟骨支架中制備相當于鈣化層的結構,才能更好地促進關節(jié)骨軟骨缺損的修復。
　　本課題組在前期實驗中,利用物理粉碎和化學脫細胞相結合的方法,提取了牛關節(jié)軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)。并采用了溫度梯度熱

5、誘導相分離(temperature gradient-guided thermal-induced phase separation,TIPS)技術,制備出具有定向微管結構的軟骨支架。以β-磷酸三鈣(tricalcium phosphate,β-TCP)、聚丙交酯-乙交酯共聚物[poly(1actic-co-glycolic acid),PLGA](兩者配比7:3)與Ⅰ型膠原作為原材料,采用快速成形(rapid prototyping,

6、RP)技術和低溫沉積鑄造(low-temperature deposition manufacturing,LDM)法,制備了具有三維結構、內(nèi)層為PLGA/β-TCP、表面包裹Ⅰ型膠原的包芯結構骨支架材料。經(jīng)實驗證實,此兩種軟骨支架與骨支架具有良好的加工和成型特性、較高的空隙率、優(yōu)秀的親水性和生物相容性、適合的機械強度和降解速度,能夠滿足骨與軟骨組織工程的理想支架材料的要求。
　　本實驗模擬鈣化層結構,在軟骨支架與骨支架之間增加了

7、致密層,目的是牢固地將兩者整合起來,以提高骨軟骨復合支架的機械力學性能;同時,希望在骨軟骨復合支架植入體內(nèi)后,致密層能將軟骨支架和骨支架上結合的細胞分隔在關節(jié)腔和骨髓腔的封閉環(huán)境內(nèi),以利于種子細胞分別向軟骨細胞和成骨細胞分化和增殖,利于骨軟骨組織的修復。具體的研究內(nèi)容如下:
　　第一部分具有致密層的骨軟骨復合支架的制備及致密層特性的研究
　　本實驗同樣采用快速成型技術,在骨支架表面噴涂 PLGA/β-TCP,形成一厚約0.5

8、mm的致密層。通過“溶解-粘連”工藝,將軟骨支架與致密層相連。這樣,帶有致密層的骨軟骨復合支架構建即可完成。本實驗還制作了沒有致密層的骨軟骨復合支架,即骨支架與軟骨支架也是通過“溶解-粘連”工藝,直接相連。以具有致密層的骨軟骨復合支架為實驗組,沒有致密層的為對照組。
　　使用電子掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)對致密層進行觀察,對致密層的孔隙率、吸水率以及液體和細胞對其通透性進行檢測,并

9、對具有致密層和沒有致密層的兩組骨軟骨復合支架的力學性能進行了檢測和比較。
　　實驗結果顯示:致密層的孔隙率、吸水率極小,有較強的疏水性,對液體和細胞無通透性;實驗組骨軟骨復合支架的最大抗拉伸力、抗剪切力顯著高于對照組(P<0.05)。以上結果提示:致密層有將軟骨細胞和成骨細胞分隔在不同的環(huán)境中的能力,并且致密層能顯著地增強骨軟骨復合支架的力學性能。
　　第二部分致密層在體外構建組織工程骨軟骨復合物中作用的研究
　　本實

10、驗從成年兔髂骨骨髓中提純、擴增骨髓間充質干細胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)后,使用不同的誘導劑,誘導其分別向軟骨細胞和成骨細胞方向分化。然后將帶致密層的骨軟骨復合支架置于本課題組自制的骨軟骨培養(yǎng)腔中,通過滴注法,把誘導形成的軟骨細胞與成骨細胞分別接種于復合支架的軟骨支架與骨支架上,繼續(xù)使用誘導劑,分別向軟骨細胞、成骨細胞方向誘導和培養(yǎng)。由于致密層的存在,軟骨支架與骨支架上的細胞被分隔在不同的環(huán)境中。利用掃

11、描電鏡觀察細胞在骨軟骨復合支架內(nèi)粘附的形態(tài),采取MTT法了解細胞在支架上增殖的情況,使用多種染色方法檢測BMSCs向軟骨細胞和成骨細胞的分化情況。
　　SEM觀察可見,在有致密層隔離的條件下,細胞在支架上伸出長長的偽足,細胞變成扁平狀并相互接觸、接連成片,深入支架孔隙的深處,完全覆蓋支架孔隙的表面。MTT法檢測結果可見,隨著培養(yǎng)時間的延長,骨軟骨復合支架上的細胞數(shù)量均顯著地升高。細胞在支架上誘導、培養(yǎng)20d后,將向軟骨細胞和成骨細

12、胞誘導的BMSCs分別從支架上消化下來,分別添加軟骨培養(yǎng)基和成骨培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)、誘導24h。向軟骨細胞誘導的BMSCs使用番紅O、甲苯胺藍、II型膠原的免疫組化染色,均呈陽性,而 I型膠原的免疫組化染色陰性;向成骨細胞誘導的BMSCs使用BCIP/NBT底物行堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP),使用茜素紅法行鈣結節(jié)染色,均呈陽性。
　　以上結果表明,在致密層將軟骨支架和骨支架上的細胞分隔在兩個不同

13、的培養(yǎng)環(huán)境中后,細胞能夠在支架上良好地粘附和增殖,顯示典型的軟骨細胞和成骨細胞的分化表型,無退化現(xiàn)象的發(fā)生,在體外可成功構建組織工程骨軟骨復合物。
　　第三部分致密層在體內(nèi)修復兔關節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究
　　本實驗將結合經(jīng)誘導的自體BMSCs的骨軟骨復合支架回植入兔膝關節(jié)骨軟骨全層缺損處,于術后3月和6月分別取材,通過對新生軟骨進行大體形態(tài)觀察、壓縮模量和分子生物學檢測,對新生軟骨下骨進行骨礦物質密度(bone miner

14、al density,BMD)檢測,以及對新生骨軟骨組織進行顯微計算機斷層掃描(Micro-computed tomography, Micro-CT)三維重建、組織學染色觀察,驗證致密層在體內(nèi)對骨軟骨復合支架修復關節(jié)骨軟骨全層缺損的影響。
　　新生軟骨的大體觀察可見,與對照組軟骨支架比,實驗組軟骨獲得了較為滿意的修復。實驗組新生軟骨的大體形態(tài)評分結果、壓縮模量、Ⅱ型膠原及其mRNA的表達均明顯高于對照組(P<0.05),術后6月

15、,其數(shù)值與正常軟骨支架相比,無顯著差異(P>0.05)。
　　新生骨軟骨的組織學染色可見,實驗組的新生骨軟骨組織的形態(tài)更優(yōu)于對照組,尤其是在術后6月,接近于正常骨軟骨組織。實驗組新生的骨軟骨的組織評分結果均顯著高于對照組(P<0.05)。此外,Micro-CT三維重建的結果,與組織學染色完全吻合。實驗組的新生軟骨下骨的BMD值亦顯著高于對照組。
　　以上實驗結果顯示,相對于對照組,實驗組新生骨軟骨組織在形態(tài)學、生物力學、分子