致密層在骨軟骨復(fù)合支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、疾病等原因,常常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的缺損,易發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA),給患者帶來巨大的痛苦。關(guān)節(jié)軟骨無血液供應(yīng),加之軟骨細(xì)胞為分裂、增殖和代謝不活躍的穩(wěn)定細(xì)胞,因而其自身修復(fù)能力極差。此外,關(guān)節(jié)軟骨全層缺損后,位于其下的軟骨下骨往往會出現(xiàn)退變、硬化等病理改變,而新生軟骨是無法與硬化、退變的軟骨下骨進(jìn)行整合的,故關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)必須考慮同時(shí)修復(fù)病變的軟骨下骨。到目前為止,臨床上采用的多種外科治療方法,均

2、未能獲得滿意的治療效果。組織工程技術(shù)的進(jìn)步,給關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的修復(fù)再來希望。近十年來,已有部分學(xué)者使用骨支架與軟骨支架的復(fù)合體,來修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨損傷。雖然獲得了部分成功,但仍有兩大問題制約其在臨床上推廣:一,軟骨支架與骨支架之間的結(jié)合力差,在關(guān)節(jié)內(nèi)不能承受各種應(yīng)力,經(jīng)常發(fā)生斷裂現(xiàn)象;二,骨軟骨復(fù)合支架上的種子細(xì)胞的增殖、分化能力差,骨軟骨組織的修復(fù)情況不佳。
　　要解決以上兩大問題,必須要對骨軟骨的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的生存環(huán)境有個(gè)充分

3、的理解。正常關(guān)節(jié)面由軟骨和軟骨下骨構(gòu)成。在微觀結(jié)構(gòu)上,軟骨分四層:淺表層、移行層、柱狀層和鈣化層。鈣化層結(jié)構(gòu)致密,實(shí)質(zhì)上是軟骨與軟骨下骨的過渡層,起著隔離軟骨和軟骨下骨的作用,同時(shí)將二者牢固地整合在一起。軟骨營養(yǎng)主要來源于關(guān)節(jié)腔滑液,而關(guān)節(jié)液中的氧濃度明顯低于軟骨下松質(zhì)骨的氧供濃度。軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境,低氧條件下有利于軟骨細(xì)胞的分化、增殖。如果血液一旦侵入關(guān)節(jié)腔內(nèi),其中一些成分會因觸發(fā)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致新生軟骨細(xì)胞凋亡或壞死。與此同時(shí),如

4、果關(guān)節(jié)液滲透入軟骨下骨,亦有害于成骨細(xì)胞,嚴(yán)重影響其活性。由此可見,尤其對于修復(fù)能力差的軟骨細(xì)胞來說,鈣化層是維持其良好狀態(tài)必不可少的條件。理想的骨軟骨組織工程支架應(yīng)模擬正常關(guān)節(jié)的骨軟骨結(jié)構(gòu),在復(fù)合骨軟骨支架中制備相當(dāng)于鈣化層的結(jié)構(gòu),才能更好地促進(jìn)關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的修復(fù)。
　　本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中,利用物理粉碎和化學(xué)脫細(xì)胞相結(jié)合的方法,提取了牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。并采用了溫度梯度熱

5、誘導(dǎo)相分離(temperature gradient-guided thermal-induced phase separation,TIPS)技術(shù),制備出具有定向微管結(jié)構(gòu)的軟骨支架。以β-磷酸三鈣(tricalcium phosphate,β-TCP)、聚丙交酯-乙交酯共聚物[poly(1actic-co-glycolic acid),PLGA](兩者配比7:3)與Ⅰ型膠原作為原材料,采用快速成形(rapid prototyping,

6、RP)技術(shù)和低溫沉積鑄造(low-temperature deposition manufacturing,LDM)法,制備了具有三維結(jié)構(gòu)、內(nèi)層為PLGA/β-TCP、表面包裹Ⅰ型膠原的包芯結(jié)構(gòu)骨支架材料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),此兩種軟骨支架與骨支架具有良好的加工和成型特性、較高的空隙率、優(yōu)秀的親水性和生物相容性、適合的機(jī)械強(qiáng)度和降解速度,能夠滿足骨與軟骨組織工程的理想支架材料的要求。
　　本實(shí)驗(yàn)?zāi)M鈣化層結(jié)構(gòu),在軟骨支架與骨支架之間增加了

7、致密層,目的是牢固地將兩者整合起來,以提高骨軟骨復(fù)合支架的機(jī)械力學(xué)性能;同時(shí),希望在骨軟骨復(fù)合支架植入體內(nèi)后,致密層能將軟骨支架和骨支架上結(jié)合的細(xì)胞分隔在關(guān)節(jié)腔和骨髓腔的封閉環(huán)境內(nèi),以利于種子細(xì)胞分別向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化和增殖,利于骨軟骨組織的修復(fù)。具體的研究內(nèi)容如下:
　　第一部分具有致密層的骨軟骨復(fù)合支架的制備及致密層特性的研究
　　本實(shí)驗(yàn)同樣采用快速成型技術(shù),在骨支架表面噴涂 PLGA/β-TCP,形成一厚約0.5

8、mm的致密層。通過“溶解-粘連”工藝,將軟骨支架與致密層相連。這樣,帶有致密層的骨軟骨復(fù)合支架構(gòu)建即可完成。本實(shí)驗(yàn)還制作了沒有致密層的骨軟骨復(fù)合支架,即骨支架與軟骨支架也是通過“溶解-粘連”工藝,直接相連。以具有致密層的骨軟骨復(fù)合支架為實(shí)驗(yàn)組,沒有致密層的為對照組。
　　使用電子掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)對致密層進(jìn)行觀察,對致密層的孔隙率、吸水率以及液體和細(xì)胞對其通透性進(jìn)行檢測,并

9、對具有致密層和沒有致密層的兩組骨軟骨復(fù)合支架的力學(xué)性能進(jìn)行了檢測和比較。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:致密層的孔隙率、吸水率極小,有較強(qiáng)的疏水性,對液體和細(xì)胞無通透性;實(shí)驗(yàn)組骨軟骨復(fù)合支架的最大抗拉伸力、抗剪切力顯著高于對照組(P<0.05)。以上結(jié)果提示:致密層有將軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分隔在不同的環(huán)境中的能力,并且致密層能顯著地增強(qiáng)骨軟骨復(fù)合支架的力學(xué)性能。
　　第二部分致密層在體外構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物中作用的研究
　　本實(shí)

10、驗(yàn)從成年兔髂骨骨髓中提純、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)后,使用不同的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)其分別向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化。然后將帶致密層的骨軟骨復(fù)合支架置于本課題組自制的骨軟骨培養(yǎng)腔中,通過滴注法,把誘導(dǎo)形成的軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞分別接種于復(fù)合支架的軟骨支架與骨支架上,繼續(xù)使用誘導(dǎo)劑,分別向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)和培養(yǎng)。由于致密層的存在,軟骨支架與骨支架上的細(xì)胞被分隔在不同的環(huán)境中。利用掃

11、描電鏡觀察細(xì)胞在骨軟骨復(fù)合支架內(nèi)粘附的形態(tài),采取MTT法了解細(xì)胞在支架上增殖的情況,使用多種染色方法檢測BMSCs向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化情況。
　　SEM觀察可見,在有致密層隔離的條件下,細(xì)胞在支架上伸出長長的偽足,細(xì)胞變成扁平狀并相互接觸、接連成片,深入支架孔隙的深處,完全覆蓋支架孔隙的表面。MTT法檢測結(jié)果可見,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,骨軟骨復(fù)合支架上的細(xì)胞數(shù)量均顯著地升高。細(xì)胞在支架上誘導(dǎo)、培養(yǎng)20d后,將向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)

12、胞誘導(dǎo)的BMSCs分別從支架上消化下來,分別添加軟骨培養(yǎng)基和成骨培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)24h。向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs使用番紅O、甲苯胺藍(lán)、II型膠原的免疫組化染色,均呈陽性,而 I型膠原的免疫組化染色陰性;向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs使用BCIP/NBT底物行堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP),使用茜素紅法行鈣結(jié)節(jié)染色,均呈陽性。
　　以上結(jié)果表明,在致密層將軟骨支架和骨支架上的細(xì)胞分隔在兩個(gè)不同

13、的培養(yǎng)環(huán)境中后,細(xì)胞能夠在支架上良好地粘附和增殖,顯示典型的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化表型,無退化現(xiàn)象的發(fā)生,在體外可成功構(gòu)建組織工程骨軟骨復(fù)合物。
　　第三部分致密層在體內(nèi)修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究
　　本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合經(jīng)誘導(dǎo)的自體BMSCs的骨軟骨復(fù)合支架回植入兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨全層缺損處,于術(shù)后3月和6月分別取材,通過對新生軟骨進(jìn)行大體形態(tài)觀察、壓縮模量和分子生物學(xué)檢測,對新生軟骨下骨進(jìn)行骨礦物質(zhì)密度(bone miner

14、al density,BMD)檢測,以及對新生骨軟骨組織進(jìn)行顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-computed tomography, Micro-CT)三維重建、組織學(xué)染色觀察,驗(yàn)證致密層在體內(nèi)對骨軟骨復(fù)合支架修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨全層缺損的影響。
　　新生軟骨的大體觀察可見,與對照組軟骨支架比,實(shí)驗(yàn)組軟骨獲得了較為滿意的修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組新生軟骨的大體形態(tài)評分結(jié)果、壓縮模量、Ⅱ型膠原及其mRNA的表達(dá)均明顯高于對照組(P<0.05),術(shù)后6月

15、,其數(shù)值與正常軟骨支架相比,無顯著差異(P>0.05)。
　　新生骨軟骨的組織學(xué)染色可見,實(shí)驗(yàn)組的新生骨軟骨組織的形態(tài)更優(yōu)于對照組,尤其是在術(shù)后6月,接近于正常骨軟骨組織。實(shí)驗(yàn)組新生的骨軟骨的組織評分結(jié)果均顯著高于對照組(P<0.05)。此外,Micro-CT三維重建的結(jié)果,與組織學(xué)染色完全吻合。實(shí)驗(yàn)組的新生軟骨下骨的BMD值亦顯著高于對照組。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對于對照組,實(shí)驗(yàn)組新生骨軟骨組織在形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、分子