TPA誘導的橫紋肌肉瘤RD細胞分化過程中生肌蛋白基因染色質重塑機制的初步研究.pdf

1、本文利用TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)對RD細胞進行分化誘導，并對其分化機制以及分化過程中早期分化標志一生肌蛋白基因啟動子區(qū)染色質的重塑以及轉錄相關因子的結合進行研究，為橫紋肌肉瘤的臨床治療提供一定的理論依據。 染色質修飾酶通過對染色質的修飾，對染色質的結構進行調整，促進或阻遏轉錄因子與DNA的結合，從而對基因的轉錄起激活或抑制作用。染色質免疫沉淀(Chromatin Imu

2、noprecipitation，ChiP)分析是近些年發(fā)展起來檢測蛋白因子在體內與染色質的結合，進而為蛋白因子參與染色質水平基因轉錄調控提供證據的方法。本研究運用該方法，檢測了TPA誘導的RD細胞分化過程中，肌細胞分化決定因子MyoD、染色質重塑復合體SWI/SNF催化亞基BRGl、乙酰轉移酶p300和p300/CBP相關因子PCAF與生肌蛋白基因啟動子區(qū)染色質的結合情況。并應用質粒瞬時共轉染及競爭性RT-PeR的方法進一步研究了PKC

3、、p38、PCAF、p300以及BRGl對生肌蛋白基因啟動子活性的影響。 一、RD細胞分化過程中的相關信號途徑。 RD細胞，主要呈圓形和多邊形，少數紡錘形；而TPA誘導處理后，RD細胞逐漸呈現典型的分化形態(tài)，如胞體伸長，細胞內顆粒物增多，出現多核肌纖維類似結構等(圖1)。與對照相比，TPA誘導分化的RD細胞，其生肌蛋白(骨骼肌早期分化標心=kz)和肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain，骨骼肌晚期分化標志)的

4、mRNA水平隨TPA作用時間的增加而增加(圖2)；而且生肌蛋白蛋白水平在24 h后表現明顯的升高，而肌球蛋白重鏈蛋白水平在TPA誘導48h后也表現明顯的增強(圖3)。提示TPA的誘導處理可能激活了生肌蛋白的完全表達，從而指導RD細胞重新進入并完成分化。PKC抑制劑GF109203X的處理可抑制TPA誘導的RD細胞生肌蛋白和肌球蛋白重鏈的蛋白表達量的升高(圖4)；p38抑制劑SB203580的處理，也可明顯抑制TPA誘導的RD細胞分化過程

5、中生肌蛋白和肌球蛋白重鏈蛋白表達的增加以及mRNA水平的升高(圖5，6)。提示PKC與p38是TPA誘導的RD細胞分化的必經途徑。 二、RD細胞分化過程中染色質調整蛋白及修飾因子與生肌蛋白基因啟動子的結合分析。TPA能誘導RD細胞分化，表明RD細胞中存在行使SWI/SNF復合物功能所需的輔助因子。我們發(fā)現，橫紋肌肉瘤RD細胞僅表達染色質重塑復合物SWI/SNF的ATPase催化亞基BRGl，而不表達BRM(圖7)。 Ch

6、IP實驗結果表明(圖8)，(1)未經TPA誘導的對照RD細胞中，MyoD、p300均可結合到生肌蛋白基因啟動子，而PCAF與BRG1在對照RD細胞中并不與生肌蛋白基因啟動子結合。(2)在TPA誘導RD細胞分化6h后，PCAF開始結合于生肌蛋白基因啟動子，而誘導12h后，BRG1開始與生肌蛋白基因啟動子結合。p38抑制劑SB203580的處理，抑制BRG1與生肌蛋白基因啟動子的結合，卻并不影響MyoD，D300以及TPA誘導的PCAF與生

7、肌蛋白基因啟動子的結合。(3)RD細胞中MyoD呈非乙?；癄顟B(tài)，在TPA誘導分化6h后MyoD開始被乙?；?圖9)。 三、RD細胞分化過程中染色質調整蛋白及修飾因子對生肌蛋白基因啟動子活性的影響。 (1)將含有報告基因表達質粒pREP4m-myog-CAT和轉染內參照質粒pM-CAT瞬時共轉染RD細胞之后加入TPA進行誘導處理，啟動子活性分析結果表明，TPA可以增強生肌蛋白基因的啟動子活性，而SB203580的處理則抑制

8、TPA對生肌蛋白基因的誘導增強效應(圖14)，進一步證實了p38是TPA激活生肌蛋白基因表達的必經環(huán)節(jié)。 (2)PKCα表達質粒或p38表達質粒pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時共轉染RD細胞，啟動子活性分析結果表明，PKCα可以增強生肌蛋白基因的啟動子活性，但p38對其無效應(圖15)，提示p38對生肌蛋白基因表達的激活還需要其它因子的參與。 (3)PCAF表達質?；騪300表達質粒與pREP4m-myo

9、g-CAT和pM-CAT瞬時共轉染RD細胞，啟動子活性分析結果表明，PCAF可以增強生肌蛋白啟動子的活性，但p300對生肌蛋白啟動子無影響(圖16)。PCAF與p38(或其顯性負突變體)表達質粒的共轉染實驗結果表明，DN-p38抑制PCAF對生肌蛋白啟動子活性的激活(IN 17)，表明PCAF在調節(jié)生肌蛋白基因的表達中可能依賴于p38的活性。轉染實驗結果還表明TSA的處理可以促進生肌蛋白基因的啟動子活性(圖18)。 (4)BRG

10、1表達質粒(或其顯性負突變體)與pREP4m-myog-CAT和pM-CAT瞬時共轉染RD細胞后，進行TPA誘導，啟動子活性分析結果表明，BRG1不影響生肌蛋白基因的啟動子活性，但能促進TPA誘導的生肌蛋白基因啟動子活性的增強，而DN-BRG1則抑制TPA對生肌蛋白基因啟動子活性的激活作用(圖19)。共轉染實驗結果還表明，DN-BRG1也抑制PKCα和 PCAF對生肌蛋白基因啟動子活性的增強(圖20，21)。這些結果均表明BRG1對于生