TGF-β1-miR-411-SPRY4和MAPK信號通路調(diào)控橫紋肌肉瘤增殖與分化的機制研究.pdf

1、目的：
　　探討TGF-β1抑制的microRNAs及其靶基因蛋白通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)人類橫紋肌肉瘤（RMS）肌分化及其分子機制，為RMS分化治療提供新的治療靶點。
　　方法：
　　（1）采用Real-time PCR技術(shù)檢測TGF-β1抑制的microRNAs在不同RMS細胞株和組織樣本中的表達,篩選出差異最明顯、最廣泛的microRNA作為研究對象。（2）利用MTT、3H胸腺嘧啶核苷摻入法檢測microRNA對

2、RMS細胞株增殖的影響。（3）構(gòu)建裸鼠成瘤性模型，觀察microRNA對活體腫瘤生長的影響；采用免疫組織化學(xué)染色檢測瘤體ki-67蛋白表達情況。（4）運用生物信息學(xué)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)資源預(yù)測miR-411-5p的靶基因（5）運用Real-time PCR技術(shù)、雙熒光素酶報告系統(tǒng)及蛋白印跡法驗證靶基因。（6）構(gòu)建 Elk-1-Luc、c-Jun-Luc熒光報告質(zhì)粒，SPRY4-siRNA或 siRNA-ctrl轉(zhuǎn)染 PKC表達質(zhì)粒處理的RMS細胞

3、株，檢測Elk-1-Luc、c-Jun-Luc熒光信號；PKC表達質(zhì)粒和SPRY4-siRNA/siRNA-ctrl共轉(zhuǎn)染RMS細胞株，檢測P-p38蛋白的變化。（7）MKK6EE表達質(zhì)粒和/或SPRY4-siRNA共轉(zhuǎn)染RMS細胞株，蛋白質(zhì)印記檢測P-p38蛋白、免疫熒光染色觀察細胞凋亡指標（caspase-3）和肌分化指標（MHC、Myosin）的變化； MKK6EE表達和/或miR-411-5p-M、I共轉(zhuǎn)染RMS細胞株，蛋白質(zhì)印

4、記法檢測P-p38蛋白、免疫熒光染色觀察細胞凋指標（caspase-3）和肌分化指標（MHC、Myosin）的變化；流式細胞技術(shù)細胞周期試劑盒檢測細胞周期的改變； miR-411-5p-M或 SPRY4-siRNA轉(zhuǎn)染RMS細胞，3H胸腺嘧啶核苷摻入法檢測細胞增殖情況，蛋白質(zhì)印記法檢測Cleaved caspase-3表達量。（8）Real-time PCR分析人RMS組織中TGF-β1與SPRY4 mRNA的相關(guān)性。（9）采用免疫組織

5、化學(xué)技術(shù)進行TGF-β1、SPRY4、P-p38蛋白染色，并進行臨床病理相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　（1）在TGF-β1敲低的RMS細胞株和組織中 miR-411-5p差異的最明顯、最廣泛。（2）miR-411-5p能夠抑制RMS細胞株的增殖。（3）miR-411-5p能夠抑制裸鼠皮下RMS腫瘤體積增長及Ki-67蛋白表達。（4）預(yù)測miR-411-5p的候選靶基因有六個，分別為calmodulin-like4(CALML

6、4), sprout homolog4(SPRY4), general transcription factor21(GTF21), transcription factor(SP2), SET nuclear oncogene(SET)和glutamate receptor metabotropic3(GRM3)。（5）SPRY4是miR-411-5p的直接靶基因。（6）SPRY4siRNA能夠增強 Elk-1-Luc、c-Jun-L

7、uc的熒光信號；siRNA-ctrl組 P-ERK P-JNK蛋白表達增加明顯，P-p38蛋白表達增加不明顯，然而 SPRY4 siRNA組蛋白印跡檢測P-ERK、P-JNK蛋白表達增加不明顯，P-p38蛋白表達增加明顯。（7）MKK6EE表達質(zhì)粒+SPRY4-siRNA組P-p38蛋白表達顯著增加，細胞凋亡指標（caspase-3）增加和肌分化指標（MHC、Myosin）的增多。MKK6EE+miR-411-5p-M組P-p38蛋白量

8、顯著增加、促進細胞凋亡指標（caspase-3）和增加肌分化指標（MHC、Myosin）表達，細胞周期在G1期細胞比例增加。miR-411-5p M或SPRY4-siRNA轉(zhuǎn)染RMS細胞，3H胸腺嘧啶核苷摻入量均明顯下降，蛋白質(zhì)印記技術(shù)檢測Cleaved caspase-3蛋白表達量增加。（8）RMS組織中TGF-β1蛋白表達量與SPRY4 mRNA表達量負相關(guān)。（9）在分化差的RMS組織中，TGF-β1和SPRY4蛋白高表達，而P-p

9、38低表達；在分化好的RMS組織中，TGF-β1和SPRY4蛋白低表達，而P-p38高表達。
　　結(jié)論：
　　1．TGF-β1負調(diào)節(jié)miR-411-5p及miR-411-5p抑制RMS細胞株的增殖能力。
　　2．SPRY4是miR-411-5p調(diào)控的下游直接靶基因。
　　3．SPRY4抑制PKC介導(dǎo)的MAPK信號通路活化，尤其是抑制p38MAPK的激活，從而阻滯RMS分化。
　　4．在人 RMS組織樣本中，