光敏劑-納米粒載體系統(tǒng)在卵巢癌光動力學治療中的實驗研究.pdf

1、[研究背景與目的] 卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，死亡率居首位。由于缺乏有效的早期篩查手段，70％的卵巢癌患者就診時已屆晚期。近年來，盡管卵巢癌手術技巧不斷提高，新型化療藥物、化療方案亦陸續(xù)投入臨床使用，但這些傳統(tǒng)的治療手段均未能顯著改善患者長期生存率，70％的晚期卵巢癌患者最終將復發(fā)并死于癌癥。復發(fā)性卵巢癌治療原則是姑息性治療，手術與化療作為主要治療手段，其治療價值尚未得到肯定。光動力學治療(photodynam

2、ic therapy，PDT)作為一種新的高選擇性腫瘤治療方法，臨床上已成功應用于食管癌、肺癌等惡性腫瘤晚期、復發(fā)性患者的姑息性治療，取得了一定的療效。對于晚期或復發(fā)性卵巢癌患者，在給予光敏劑后，于手術過程中開腹或通過腹腔鏡將光源導入腹腔，對術后殘存的微小病灶進行彌漫性照射，或者對大的孤立性病灶行局部照射，即行腹腔光動力學治療(intraperitonneal photodynamic therapy，TPPDT)，可以成為晚期或復發(fā)性

3、卵巢癌患者新的輔助治療或姑息性治療手段。 近年來隨著納米科技的飛速發(fā)展，納米藥物的研究成為藥物研究中一個很有生命力的新方向。將藥物制備成納米級顆?；蛘呤褂眉{米載體攜帶藥物，可以使藥物具備新的特別的性質(zhì)，如改善藥物的溶解性、增強藥物的靶向性、緩釋性、可控性、智能性以及降低毒性等。本研究中，我們以國產(chǎn)二代光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)、竹紅菌素B(HB)為原料藥物，采用乳化聚合一二步法制備成功了HMME(HB)-聚氰基丙烯酸正丁酯納

4、米粒載體系統(tǒng)，通過均勻設計優(yōu)化處方與制備工藝。使用高效液相色譜技術(HPLC)測定納米粒載體系統(tǒng)攜帶藥物經(jīng)腹腔注射后在荷瘤Fischer 344大鼠以及家兔體內(nèi)各臟器藥物分布以及藥物代謝動力學數(shù)據(jù)，驗證了納米載體的緩釋、長效以及淋巴靶向等特性。通過體內(nèi)、體外實驗驗證了：HMME/HB對卵巢癌細胞以及動物體內(nèi)移植瘤的PDT效應，同時對光敏劑在細胞內(nèi)亞細胞器定位、PDT誘導線粒體相關調(diào)亡以及調(diào)亡相關蛋白的表達在分子生物學水平進行了研究。

5、 第一章竹紅菌乙素一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)的研制及其藥物代謝動力學、藥效學研究 [目的] 研制聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)，攜帶光敏劑竹紅菌素B用于卵巢癌光動力學治療。 [材料與方法] 1、以聚氰基丙烯酸正丁酯(Poly butyl cyanoacrylate,PBCA)為納米粒載體材料，采用乳化聚合一二步法制備竹紅菌乙素一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)(HB-PBCA-NP)，均勻設

6、計優(yōu)化處方與制備工藝，電子顯微鏡、激光散射粒度分析儀、紫外分光光度法進行形態(tài)、粒徑、分布、載藥量、包封率研究。 2、體外培養(yǎng)大鼠低分化上皮性卵巢癌細胞株NuTu—19，收集細胞后接種Fischer344大鼠腹腔，建立卵巢癌腹水瘤模型。相同劑量(10mg/Kg)HB-PBCA-NP與HB-DMSO(對照組)經(jīng)大鼠腹腔注射后，于不同時間點處死動物，取腹腔臟器、腫瘤組織和血清標本，提取組織中藥物，行HPLC分析其藥物代謝動力學以及藥物

7、組織分布特點。 3、建立相同動物模型，行腹腔PDT治療。動物隨機分為4組：組A未接受任何治療，僅隨訪觀察；組B接受腹腔腫瘤細胞減滅術；組C術后接受HB-DMSO-PDT治療；組D術后接受HB-PBCA-NP-PDT治療。PDT組藥物劑量均為10 mg/Kg，激光光照劑量50 J/cm2。PDT后觀察動物生存率，與對照組比較確定PDT對大鼠卵巢癌腹水瘤模型的療效。 [結果] 1、HB-PBCA-NP最佳優(yōu)化處方

8、與工藝為：PBCA用量為0.07ml，乳化劑P1uronicF-127用量為58mg，穩(wěn)定劑Dextran-70用量為22mg，pH值為1.5，攪拌時間為4h。根據(jù)優(yōu)化工藝制得三批HB-PBCA-NP，電子透射顯微鏡下為圓整均勻的球形顆粒，無粘連。激光散射粒度分析儀測得毫微粒平均粒徑為72 nm，分布范圍30～300nm，載藥量為15％，包封率為92.7％。建立紫外分光光度法質(zhì)量控制方法與標準，在20～70μg/ml范圍內(nèi)以濃度對吸光

9、度進行線性回歸，得線性方程為y=0.010537x+0.063162(r=0.9993)，日內(nèi)與日間精密度RSD分別為1.12％、1.46％，平均回收率為99.7％。 2、建立了高效液相色譜法測定HB血藥濃度及在體內(nèi)各組織分布的方法，生物樣品預處理方法簡單，在所選色譜條件下，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾HB的測定，回收率高，重現(xiàn)性好。荷瘤大鼠組織器官分布實驗結果表明，HB-DMSO消除半衰期(t<,1/2>)為9.449h，HB-PBCA-N

10、P消除t<,1/2>為12.944h。 3、手術后HB-DMSO-PDT、、HB-PBCA-NP-PDT組大鼠生存率分別為31.1％和33.3％，中位生存時間分別為95天(95％CI 86.68～103.316天)和99天(95％CI 90.24～107.74天)，兩組生存時間無統(tǒng)計學差異(P=0.293)。空白對照組組與單純手術組中位生存時間分別為76(95％CI 69.8～82.2天)和84天(95％CI 81.08～86

11、.92天)(P<0.05)。與對照組比較，手術以及手術后PDT均能夠延長大鼠生存時間，術后PDT與單純手術比較亦能夠延長大鼠生存時間(P均小于0.05)。 [結論] 本研究成功制備了HB-PBCA-NP載體系統(tǒng)，HB制成納米粒后具有緩釋長效作用，半衰期顯著延長；HB-PBCA-NP、HB-DMSO腹腔給藥后PDT均可顯著延長Fisecher344大鼠腹水瘤模型的生存期。 第二章 血卟啉單甲醚一聚氰基丙烯酸正丁酯

12、納米粒載體系統(tǒng)的研制及其淋巴靶向性研究 [目的] 制備血卟啉單甲醚一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)，驗證其在家兔體內(nèi)的淋巴靶向性 [材料與方法]1、建立血卟啉單甲醚原料藥的高效液相色譜分析方法，使用與PART 1.1相同的方法建立血卟啉單甲醚—聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)(HMME-PBCA-NP)，并進行處方、工藝優(yōu)化。 2、家兔腹腔注射相同劑量HMME-PBCA-NP與HMME注射液(15m

13、g/Kg)，不同時間點處死動物后取腹腔臟器與腹腔淋巴組織，行HPLC分析比較HMME-PBCA-NP與HMME注射液在腹腔淋巴結中的分布。 [結果] 1、HMME-PBCA-NP最佳優(yōu)化處方與工藝為：PBCA用量為0.07ml，乳化劑PluronicF-127用量為68mg，穩(wěn)定劑Dextran-70用量為79mg，HMME用量2mg，pH值為1.5，攪拌時間為4h。根據(jù)優(yōu)化工藝制得三批HB-PBCA-NP，電子透射顯

14、微鏡下為圓整均勻的球形顆粒，無粘連。激光散射粒度分析儀測得毫微粒平均粒徑為167nm，包封率為91.2％，載藥量為23％。 2、腹腔給藥1、3、6、12、24h后HMME-PBCA-NP組腹腔淋巴結藥物濃度分別為0.56±0.03、0.8±0.02、0.35±0.01、0.22±0.005、0.16±0.01μg/g，而對照組分別為0.13±0.005、0.16±0.004、0.13±0.002、0.1±0.001、0.09±0

15、.00 μg/g。HMME-PBCA-NP腹腔給藥后家兔腹腔淋巴結中藥物濃度顯著高于對照組HMME注射液(P<0.05)。 [結論] 本研究成功制備了HMME-PBCA-NP載體系統(tǒng)，經(jīng)腹腔注射后納米?？蓴y帶藥物選擇性的進入腹腔淋巴組織，具有一定程度的淋巴靶向性。 第三章 竹紅菌素B、血卟啉單甲醚對卵巢癌細胞光毒性的體外實驗研究 [目的] 探討血卟啉單甲醚、竹紅菌乙素在卵巢癌細胞系NuTu—1

16、9中的分布特點以及其體外光毒性。 [材料與方法] NuTu—19腫瘤細胞與光敏劑(HB，30 μ g/ml；HMME，60 μ g/ml)、亞細胞器探針(RHl23，lOug/ml；Lucifer Yellow，120ug/m1)共同孵育后，熒光顯微鏡下以特定激發(fā)波長激發(fā)光敏劑與熒光探針，觀察光敏劑細胞內(nèi)定位；MTT比色法測定不同劑量藥物(HMME/I-HB，0～20ug/m1)和激光劑量(O～6J/cm<'2>)配伍組

17、PDT后NuTu-19細胞的存活率；HMME-PDT/HB-PDT后流式細胞儀分析細胞死亡形式，線粒體相關調(diào)亡檢測試劑盒檢測線粒體破壞情況。 [結果] HMME與HB在細胞內(nèi)均呈現(xiàn)紅色熒光，RH-123、Lucifer Yellow單獨染色后細胞漿內(nèi)均可見綠色點狀熒光；HB與RH-123、Lucifer Yellow共同孵育后細胞漿內(nèi)均可見黃色共同染色區(qū)域；而H刪E與RH-123共同孵育后，細胞內(nèi)未見黃色共同染色

18、區(qū)域，HMME與Lucifer Yellow共同孵育后細胞內(nèi)可見黃色共同染色區(qū)域。單純激光照射，無論光照強度大小對細胞存活率均無影響(P>0.05)；單純光敏劑(HMME/HB)作用于細胞，無論藥物劑量大小(O～20ug/m1)細胞生存率亦不受影響(p>0.05)；當光敏劑與光照同時作用于細胞時，細胞生存率隨光照劑量和藥物劑量的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)劑量一效應關系曲線。不同激光照射組間細胞生存率存在統(tǒng)計學差異(p=0.004)，不同藥物濃

19、度組間細胞生存率存在統(tǒng)計學差異(p=0.001)。Annexin V/PI雙染色流式細胞儀分析結果發(fā)現(xiàn)HB-PDT、HMME-PDT。處理后4h、8h死亡細胞均以壞死細胞為主，調(diào)亡細胞所占比例均不超過2％。HB-PDT/HMME-PDT。后細胞內(nèi)線粒體均被破壞，線粒體陰性率達100％。 [結論] HB可定位于NuTu-19細胞溶酶體和線粒體上，HMME在細胞線粒體上無分布；HB-PDT/HMME-PDT對NuTu-19具

20、有體外光毒性，盡管其均可破壞細胞線粒體，其殺傷細胞方式主要為壞死而非調(diào)亡。 第四章 血卟啉單甲醚對卵巢癌光動力學治療的體內(nèi)、體外實驗研究 [目的] 探討血卟啉單甲醚對卵巢癌細胞系SKOV3及其裸鼠皮下移植瘤的光動力學治療療效 [材料與方法] 分光光度計、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測HMME吸收光譜以及其在細胞內(nèi)的熒光分布；MTT比色法測定不同劑量藥物和激光配伍組SKOV3細胞的存

21、活率；Annexin V/PI雙染色，流式細胞儀分析細胞死亡機制；建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察}tMME-PDT(10 mg/Kg，120 J/cm<'2>)對實體腫瘤的治療作用。 [結果] HMME于620 nm處有一吸收峰，是理想的PDT治療光源波長；HMME在細胞內(nèi)呈紅色熒光，分布局限于細胞漿內(nèi)。當濃度≥30μg/ml時，PDT對SKOV3光毒性進入平臺期；而低劑量PDT時呈現(xiàn)明顯的劑量．效應關系；高濃度HMM