光敏劑TMPYP4光動(dòng)力治療宮頸癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，位于婦女惡性腫瘤的第二位，90年代初，WHO宣布人乳頭瘤病毒(humanpapillomaviruses，HPV)是引起宮頸癌變的首要因素，因此，宮頸液基細(xì)胞學(xué)和HPV病毒聯(lián)合檢測技術(shù)明顯提高了宮頸癌篩查的準(zhǔn)確率，尤其是對(duì)早期宮頸病變的發(fā)現(xiàn)有很大的幫助，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)宮頸癌或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變患者的年齡趨于年輕化，對(duì)生育和性生活質(zhì)量的要求較高，傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、放化療等對(duì)生殖

2、器官功能的保留不太理想，光動(dòng)力療法可能成為一種新的能保留生育功能的治療方法。另外，對(duì)于年齡較大的晚期宮頸癌患者，一般情況差難以耐受化療及放療的不良反應(yīng)時(shí)，光動(dòng)力治療也成為可選擇的治療方式之一。
　　光動(dòng)力療法(PDT)是基于病變細(xì)胞選擇性的吸收光敏劑并在特定波長激光的激發(fā)下產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)，對(duì)病變細(xì)胞或者組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)。PDT現(xiàn)廣泛應(yīng)用于皮膚科、呼吸、消化、婦科等臨床科室，成為近年研究的熱點(diǎn)，但在發(fā)現(xiàn)PDT治療作用的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)

3、其副反應(yīng)有時(shí)是嚴(yán)重的，如皮膚發(fā)生紅斑、水泡等光敏性皮炎、皮膚潰瘍等。
　　我們本次實(shí)驗(yàn)選用的光敏劑是四甲基吡啶卟啉(5，10，15，20-tetra-(N-methyl-4-pyridyl)porphyrin，TMPyP4)，屬于卟啉衍生物，是一種新型的水溶性光敏劑，可以結(jié)合并穩(wěn)定人類端粒G-四鏈體的形成，抑制端粒酶的功能，而目前研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤增殖失控的關(guān)鍵在于端粒酶的激活，因此，TMPyP4通過穩(wěn)定G-四鏈體的結(jié)構(gòu)，從而降低端

4、粒酶活性，將其作用于腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長停止，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但近年有研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性在一些正常細(xì)胞中也被檢測到，如外周血、骨髓細(xì)胞和皮膚的基底層等組織。因此，卟啉類光敏劑和端粒酶的相互作用可能會(huì)影響機(jī)體的正常細(xì)胞，在正常組織產(chǎn)生副作用。另外，TMPyP4本身是一種光敏劑，在適當(dāng)波長的激光照射下可發(fā)生光敏反應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用，因此從理論基礎(chǔ)上分析，TMPyP4是一種對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞殺傷作用比較強(qiáng)的藥物，但它有腫瘤選擇

5、特異性較差的缺點(diǎn)，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)也可能發(fā)生相關(guān)的光敏副反應(yīng)，如皮膚潰瘍、臟器損傷等，因此為了避免全身副反應(yīng)的發(fā)生，我們選擇在腫瘤局部用藥方案。
　　Survivin和Caspase-3是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要分子，Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子。有研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可能通過某種機(jī)制間接抑制Caspase-3的活性而抑制細(xì)胞凋亡，而Caspase-3是Caspase家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的重要成員之

6、一，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，大多數(shù)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，最終都通過激活Caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前，已有TMPyP4抑制端粒酶活性的報(bào)道，但TMPyP4-PDT對(duì)促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Survivin和Caspase-3的表達(dá)影響研究較少，本研究中我們通過觀察TMPyP4-PDT對(duì)裸鼠Hela細(xì)胞移植瘤的作用來探討其對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制。
　　根據(jù)我們前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果:TMPyP4-PDT對(duì)宮頸癌

7、hela、siha細(xì)胞均有顯著殺傷作用，而宮頸癌hela、siha細(xì)胞對(duì)TMPyP4-PDT的敏感性不同，宮頸癌hela細(xì)胞較敏感。因此，我們動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇宮頸癌hela細(xì)胞接種雌性BALB/c裸小鼠，觀察TMPyP4-PDT對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用。
　　因?yàn)镻DT殺傷腫瘤細(xì)胞的效果取決于光敏劑濃度和光的能量密度，我們曾用光敏劑TMPyP4的較大濃度(20mg/kg)對(duì)裸鼠宮頸癌移植瘤行瘤周注射，發(fā)現(xiàn)在沒有激光照射的情況下就發(fā)生了皮

8、膚潰爛，持續(xù)時(shí)間較長（四周）。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)我們也曾選擇經(jīng)尾靜脈注射光敏劑給動(dòng)物全身用藥(10mg/kg)，發(fā)現(xiàn)光敏劑在尾靜脈中長時(shí)間聚集，避光四周，然后移至自然光線下放置2天發(fā)現(xiàn)裸鼠尾巴部分出現(xiàn)干性壞死(見圖1-2)，而腫瘤增大明顯，生長未被抑制，裸鼠消瘦，提示全身用藥治療效果不理想。
　　綜上所述，為了較大限度的降低TMPyP4-PDT副反應(yīng)，同時(shí)又能達(dá)到治療宮頸癌的效果，我們設(shè)計(jì)多次低劑量TMPyP4-PDT的治療方案，通過局部瘤

9、體內(nèi)用藥方法來探討TMPyP4-PDT對(duì)宮頸癌的治療作用，并探討其促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　第一部分:光敏劑TMPyP4多次低劑量光動(dòng)力療法治療宮頸癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的:光動(dòng)力療法(PDT)是一種近年研究發(fā)現(xiàn)的適合治療宮頸癌的新方法，但光動(dòng)力療法的副作用有時(shí)是嚴(yán)重的，為了減少光敏療法副反應(yīng)的發(fā)生，又能在較大程度上達(dá)到治療惡性腫瘤的效果，我們設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)來研究觀察TMPyP4多次低劑量光動(dòng)力療法對(duì)裸鼠宮頸癌Hel

10、a細(xì)胞移植瘤的治療效果及副反應(yīng)。
　　材料與方法:雌性BALB/c裸小鼠（5-6周，稱重18-20克）20只，SPF級(jí)條件飼養(yǎng)，裸鼠皮下注射宮頸癌Hela細(xì)胞（1×107細(xì)胞/200uL），瘤細(xì)胞接種10天后，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的荷瘤小鼠為18只，標(biāo)準(zhǔn)成瘤率為90％，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只(n=6)，A組為對(duì)照組，無任何治療;B組為一次用藥光療組，用TMPyP4(10mg/kg)瘤內(nèi)注射和照射藍(lán)色激光(108J/cm2)一次，藥物

11、注射與激光照射間隔時(shí)間為6小時(shí);C組為三次用藥光療組，用TMPyP4(10mg/kg)瘤內(nèi)注射和照射藍(lán)色激光(108J/cm2)三次，每次治療間隔時(shí)間2天。開始治療后，監(jiān)測腫瘤體積，在C組治療結(jié)束后2周，比較各組腫瘤體積大小，同時(shí)觀察裸鼠生活狀態(tài)以及皮膚和組織器官的損害情況及血液中血常規(guī)和肝腎功能的變化情況。
　　結(jié)果:C組移植瘤體積與A組和B組比較明顯受到抑制(P＜0.05);而實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)治療組裸鼠體重增加，生活狀態(tài)良好，對(duì)照組

12、體重下降，生活狀態(tài)較差;另外治療組裸鼠皮膚和內(nèi)臟器官未見明顯損傷，血常規(guī)和肝腎功能與對(duì)照組相比無明顯變化，同時(shí)腫瘤切片HE染色發(fā)現(xiàn)C組移植瘤細(xì)胞凋亡明顯增多。
　　結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明，多次低劑量TMPyP4光動(dòng)力治療可顯著抑制裸鼠宮頸癌移植瘤的生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，治療組裸鼠生活狀態(tài)良好，未見消瘦，血常規(guī)和肝腎功能無明顯變化，同時(shí)皮膚及內(nèi)臟器官未見明顯副反應(yīng)發(fā)生。
　　第二部分:TMPyP4-PDT對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤

13、細(xì)胞凋亡及Survivin和Caspase-3表達(dá)影響的研究
　　研究目的:細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由一系列酶參與、多種基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，目前細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制仍不清楚，但細(xì)胞往往會(huì)激活相對(duì)立的兩個(gè)過程，凋亡和抗凋亡，由兩種信號(hào)通路的強(qiáng)弱對(duì)比決定最后的結(jié)局。所以，細(xì)胞凋亡一直是惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)，也是藥物治療研究的靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量光敏劑光動(dòng)力治療導(dǎo)致

14、細(xì)胞凋亡，而高劑量光動(dòng)力療法主要引起細(xì)胞壞死。我們采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)研究觀察TMPyP4-PDT治療組宮頸癌細(xì)胞的凋亡情況，TUNEL法的原理是生物素或熒光素等標(biāo)記物被標(biāo)記在DNA缺口末端的3'-OH上，在TdT催化下，通過標(biāo)記物顯色系統(tǒng)在組織細(xì)胞原位檢測凋亡細(xì)胞，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或凋亡小體進(jìn)行原位染色，與普通HE染色方法相比，能更準(zhǔn)確的反映細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)比。生存素(Survivin)和半胱氨

15、酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制中是兩個(gè)比較關(guān)鍵的因子，本研究聯(lián)合檢測Survivin和Caspase-3在裸鼠宮頸癌移植瘤中的表達(dá)，探討TMPyP4-PDT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　材料與方法:按照實(shí)驗(yàn)第一部分分組情況，取各組移植瘤石蠟切片，用TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，用全自動(dòng)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和結(jié)果分析。TUNEL檢測方法為每例標(biāo)本隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，檢測1000個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所

16、占百分比計(jì)數(shù)為凋亡指數(shù)(AI)。survivin和caspase-3蛋白的檢測采用免疫組化SP法，免疫組化陽性為細(xì)胞漿中棕黃色顆粒，采用全自動(dòng)顯微鏡和圖像采集分析系統(tǒng)，每只裸鼠選3張切片進(jìn)行分析，每張切片連續(xù)讀取10張高倍視野，計(jì)算每視野陽性染色的光密度(OD)值，最后計(jì)算每組裸鼠的平均光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果顯示，TUNEL陽性細(xì)胞以綠色熒光表示。TMPyP4-PDT三次治療組的TUNEL陽性（綠色熒