文蛤(Meretrix meretrix)殼色花紋性狀的分子遺傳基礎(chǔ)研究.pdf

1、文蛤（Meretrix.meretrix）是我國(guó)沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)貝類，其豐富多彩的殼色花紋可以遺傳給后代，并且與生長(zhǎng)、抗逆等經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)，一些色澤鮮艷的文蛤商業(yè)價(jià)值顯著提高。許多水生動(dòng)物體色、殼色多態(tài)性的產(chǎn)生是由于體內(nèi)控制色素合成的基因發(fā)生變異，而且紅、黃體色的形成與自身類胡蘿卜素的含量密切相關(guān)，培育殼色艷麗的文蛤新品系對(duì)文蛤養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。在表觀遺傳學(xué)研究中，DNA胞嘧啶甲基化現(xiàn)象影響著生物體表型的改變，是真核生物基因

2、組DNA修飾加工的方式之一。本研究以4個(gè)文蛤品系（紅殼、黑斑、白殼和細(xì)紋）為試驗(yàn)材料，顯微觀察其外套膜色素帶并采用分光光度計(jì)法對(duì)紅殼和白殼文蛤外套膜中的類胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定；從文蛤轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選出類胡蘿卜素積累過程的兩個(gè)關(guān)鍵酶——GGPP合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPS）、β-胡蘿卜素加氧酶（beta,beta-carotene9',10'-oxygenase-like，c

3、rtO）的EST序列，利用RACE技術(shù)獲得了GGPS和crtO基因的cDNA全長(zhǎng)，并利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GGPS和crtO基因在不同殼色文蛤（紅殼、粉紅殼、黑斑和白殼）外套膜、紅殼文蛤不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析，試圖探究類胡蘿卜素在不同殼色文蛤外套膜中的沉積規(guī)律，為文蛤呈色機(jī)理的研究提供依據(jù)；此外，利用MSAP標(biāo)記技術(shù)分析4種殼色文蛤甲基化差異，探索DNA甲基化和文蛤殼色之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采

4、用顯微觀察法觀察紅殼和白殼文蛤外套膜色素帶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑斑個(gè)體的外套膜邊緣近貝殼面有一條較深的色素帶，而且在同一貝殼上黑斑區(qū)域的色素帶清晰，非黑斑區(qū)域無(wú)色素帶；紅殼個(gè)體的外套膜邊緣有一條紅色的色素帶，而白殼色個(gè)體沒有色素帶。分光光度法測(cè)定和 SPASS軟件分析發(fā)現(xiàn)，紅殼和白殼文蛤體內(nèi)總類胡蘿卜素含量存在極顯著差異，分別為1.703ug/100g和0.50ug/100g。
　　2.獲得了文蛤GGPP合成酶基因的cDNA全長(zhǎng)序列，該c

5、DNA全長(zhǎng)1130bp，開放閱讀框882bp，編碼293個(gè)氨基酸，推算分子量約為33.7kDr，理論等電點(diǎn)為6.64；氨基酸序列比對(duì)表明，其與非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）和海蝸牛（Aplysia californica）的序列有較高同源性，分別達(dá)到74.1％和73.7%；對(duì)其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白具有異戊二烯轉(zhuǎn)移酶中2個(gè)保守的特征結(jié)構(gòu)域（LLIDDIEDNSNLRRG和LGLYFQIRDDYAN）。crtO基因的cDN

6、A全長(zhǎng)為2967bp，開放閱讀框1827bp，編碼608個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量68.09kDa，理論等電點(diǎn)為5.58；該基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與雞（Gallus gallus）和綠海龜（Chrysemys picta bellii）的相似性分別為50.1%和45.5%。
　　3.利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)GGPS和crtO基因在文蛤紅殼、粉紅殼、黑斑和白殼群體外套膜中的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GGPS和crtO基因在紅殼文蛤中

7、的表達(dá)量均最高，粉紅殼和黑斑次之，白殼最低，由此初步推測(cè)文蛤殼色的形成與體內(nèi)類胡蘿卜素相關(guān)。
　　GGPS基因和crtO基因在紅殼文蛤不同發(fā)育時(shí)期（卵子、細(xì)胞、囊胚、原腸胚、單輪期、眼點(diǎn)和稚貝）的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，GGPS基因和crtO基因在各發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，其中在眼點(diǎn)期的表達(dá)量極高，明顯區(qū)別于其他發(fā)育階段，另外，兩基因在各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量總體上呈現(xiàn)不統(tǒng)一的上調(diào)與下調(diào)交互的趨勢(shì)。GGPS在原腸胚和囊胚期的表達(dá)量基本相近，crtO基

8、因在囊胚和單輪期的表達(dá)量基本相近。到稚貝期，兩基因的表達(dá)量都較眼點(diǎn)略低，但GGPS的下降幅度遠(yuǎn)大于crtO基因。GGPS基因和crtO基因在紅殼文蛤不同組織（鰓、外套膜、閉殼肌、足、內(nèi)臟團(tuán)和水管）的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，GGPS基因和crtO基因在外套膜中的表達(dá)量顯著高于其它組織，并且GGPS基因在外套膜中的表達(dá)量又高于crtO基因。
　　4.利用MSAP分析技術(shù)對(duì)紅殼、黑斑、細(xì)紋和白殼4種殼色文蛤的甲基化水平及殼色差異性位點(diǎn)進(jìn)行分析。