重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族N末端聚乙二醇化學(xué)修飾.pdf

1、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-10(Human fibroblast growth factor-10；KGF-2；又稱為角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(Keratinocyte Growth Factor-2))系成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的重要成員,它是來(lái)源于胚胎上皮細(xì)胞的一種堿性蛋白,由208個(gè)氨基酸殘基組成,主要在間充質(zhì)細(xì)胞合成,通過(guò)與上皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的受體作用,特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移。KGF-2在新生或成年間質(zhì)成纖維細(xì)胞系、成年人的腎

2、、胃腸道臟器等均有表達(dá)。KGF-2的作用主要表現(xiàn)為抗肝肺組織纖維化、促進(jìn)創(chuàng)傷性組織損傷、慢性組織損傷(糖尿病患者的持續(xù)性損傷)以及靜脈潰瘍(包括腸胃的慢性潰瘍)的修復(fù)和愈合等,具有廣泛的應(yīng)用前景,但是,長(zhǎng)期的研究及臨床實(shí)踐表明KGF-2與其它蛋白質(zhì)藥物一樣,也存在體內(nèi)穩(wěn)定性差、生物半衰期短、易發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)等缺陷,從而也大大限制了臨床應(yīng)用。
　　 為了提高KGF-2的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)半衰期,本文使用目前應(yīng)用較多的專門(mén)針對(duì)N末端氨基

3、修飾的PEG-20KD丁醛修飾制劑,采用正交實(shí)驗(yàn)考察了不同溫度、反應(yīng)時(shí)間、緩沖溶液(PBS)pH值及修飾制劑和蛋白質(zhì)物質(zhì)量之比四個(gè)因素對(duì)修飾結(jié)果的影響。并對(duì)修飾產(chǎn)物的分離制備、活性、穩(wěn)定性、免疫反應(yīng)性和免疫原性、藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)作了較為系統(tǒng)的研究,結(jié)果如下:
　　 1)以PEG20kd與rhKGF-2在摩爾比為9:1,溫度為25℃,pH為6.0,時(shí)間為15h反應(yīng)條件下修飾率最高,將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)凝膠掃描和HPLC

4、分析,修飾率最高達(dá)到31.63％:
　　 2)將反應(yīng)物采用肝素親和層析,采用梯度洗脫來(lái)進(jìn)行分離純化,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,0.6mol/L NaCl+20mmol/LPBS的洗脫峰即為PEG-rhKGF-2,采用反相高效液相色譜(C18柱)分析純化得到的PEG-rhKGF-2的,其純度超過(guò)99％:
　　 3)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)修飾產(chǎn)物的活性,結(jié)果表明PEG-rhKGF-2有更著的促NRK52E細(xì)胞增殖作用,并且在

5、一定的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)作用與劑量成正相關(guān)；
　　 4)穩(wěn)定性結(jié)果檢測(cè)表明,修飾產(chǎn)物在大鼠血清中熱穩(wěn)定性明顯高于修飾前的rhKGF-2,同時(shí)PEG-rhKGF-2比rhKGF-2抗胰蛋白酶水解能力明顯增加；
　　 5)修飾產(chǎn)物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明,rhKGF-2經(jīng)PEG化學(xué)修飾后,體內(nèi)半衰期(t1/2)提高了將近6倍,由2.6 min提高到15.5 min；
　　 6)修飾產(chǎn)物的體內(nèi)免疫原性檢測(cè)表明,rhKGF-