轉(zhuǎn)染FasL基因的豬軟骨細(xì)胞抑制同種異體移植免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討構(gòu)建FasL基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染豬軟骨細(xì)胞的表達(dá)及其抑制同種異體移植免疫排斥反應(yīng)的作用.方法:1、通過RT-PCR法克隆豬FasL基因,連入pGEM-T載體中測序鑒定,經(jīng)酶切后亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGCEN中,構(gòu)建pGCEN-FasL逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體;2、pGCEN-FasL逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)PA317包裝,產(chǎn)生高滴度的病毒液,感染豬耳軟骨細(xì)胞,經(jīng)G41 8篩選獲得抗性克隆.應(yīng)用FACS和Western blot檢測轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞

2、FasL的表達(dá),通過JAM試驗(yàn)測定FasL<'+>軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞、活化T細(xì)胞的凋亡率,證實(shí)其免疫生物學(xué)功能;3、在貴州香豬體內(nèi)植入組織工程化FasL+軟骨細(xì)胞及FasL-的軟骨細(xì)胞,分別在軟骨結(jié)節(jié)形成后的第2周、第3周取材.經(jīng)組織病理和免疫組化染色,觀察、檢測新生的FasL<'+>軟骨組織生長狀況和免疫排斥的抑制.結(jié)果:1、經(jīng)雙酶切和測序鑒定,成功地克隆了豬FasL基因,并構(gòu)建了pGCEN-FasL逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體.應(yīng)用

3、FACS檢測經(jīng)載體轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞FasL表達(dá)率達(dá)57％,Western blot顯示在37kD處有一特異性蛋白條帶.2、在體外,FasL<'+>軟骨細(xì)胞對Jurkat細(xì)胞、活化T細(xì)胞的最大凋亡率分別為53.4％,30.3％(E/T=10:1),對照組分別為32.2％,13.1％(E/T=10:1),差異顯著,表明FasL<'+>軟骨細(xì)胞可有效地發(fā)揮免疫抑制功能;3、在體內(nèi),移植FasL+軟骨細(xì)胞的形態(tài)與正常軟骨組織基本一致,結(jié)節(jié)形成后第