地磷莫司抑制同種異體器官移植免疫排斥作用及機制研究.pdf

1、目的:器官移植是解決終末器官衰竭的最佳途徑之一，心臟移植與胰島移植已分別應(yīng)用于各自臨床領(lǐng)域，并起到不錯的效果。但是臨床應(yīng)用中遇到最大的問題就是免疫排斥問題，自身的免疫排斥導(dǎo)致移植器官過早的衰竭而失去功能，出現(xiàn)一系列生理問題，無法正常生活，嚴(yán)重影響到移植后患者的生命和器官移植在臨床的應(yīng)用。為了抑制免疫，保護移植器官，延長移植物生存期，延長終末期疾病患者的生命，臨床上已應(yīng)用多種免疫抑制劑，但是因為其價格昂貴，毒副作用強等原因阻礙了其在臨床的

2、應(yīng)用，因此開發(fā)新型的毒副作用小的免疫抑制劑具有重要的意義。作為首例絲氨酸/蘇氨酸激酶mTOR結(jié)合藥物，雷帕霉素在臨床的應(yīng)用己得到公認(rèn)，其結(jié)合mTOR可以控制細胞代謝、增殖、分化，同時也是抗癌的一個重要機制。但是由于雷帕霉素的水溶性較弱、半衰期長、化學(xué)穩(wěn)定性較弱，其在器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用中受到了限制，使其無法達到器官移植免疫抑制的有效濃度。雷帕霉素的C40是一個理想的藥物化學(xué)改變位點，C40遠離FKBP12和mTOR的主要結(jié)合位點，對其進行

3、二甲基磷?；?，得到具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高生物利用度等優(yōu)點的地磷莫司。地磷莫司的諸多優(yōu)點使其得到FDA快速批準(zhǔn)應(yīng)用于軟組織與骨肉瘤的治療，其關(guān)于治療血液癌（淋巴瘤和白血?。┑亩谂R床試驗已經(jīng)完成，子宮內(nèi)膜癌的二期臨床試驗也已展開。而其關(guān)于免疫抑制作用的研究未見報道。為了開發(fā)其在器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用，我們擬借助胰島移植、心臟移植模型以及體外實驗，研究其免疫抑制機制，為地磷莫司進一步進行臨床試驗打下基礎(chǔ)，為其能順利應(yīng)用于臨床器官移植做好鋪墊

4、。
　　方法:我們首先在體外實驗中研究地磷莫司的免疫抑制作用及其作用機制。采用混合淋巴細胞培養(yǎng)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗等確定其具有免疫抑制作用，再用凋亡實驗、克隆無能實驗、CFSE、ELISA等探討地磷莫司的免疫抑制作用機制及其影響細胞分泌的炎性因子情況;其次，我們建立了小鼠胰島移植模型和小鼠心臟移植模型，研究地磷莫司保護移植物、延長移植物生存期的作用;最后，我們通過對受體鼠體內(nèi)移植物病理切片、供者特異性抗原引起的免疫應(yīng)答能力、T細胞亞

5、群、調(diào)節(jié)性T細胞等進行分析，試圖闡明地磷莫司抑制同種異體器官移植免疫排斥反應(yīng)，延長移植物生存期的機制，以此來分析其作為免疫抑制劑應(yīng)用于器官移植的可行性。
　　結(jié)果:在體外實驗中，我們首先運用淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗確定了地磷莫司可以抑制淋巴細胞/T細胞的增殖，我們用供體特異性抗原（Balb/c細胞）刺激受體細胞增殖實驗驗證了地磷莫司在體外可以抑制供體特異性抗原刺激的細胞增殖，且地磷莫司濃度為1ng/mL的時候已達到最佳的抑制增殖效果;我們

6、運用CFSE標(biāo)記的方法驗證了地磷莫司可以同時抑制CD4+/CD8+T細胞的供體特異性抗原刺激的增殖，且對CD4+T細胞的抑制效果更顯著;我們用流式檢測了地磷莫司對淋巴細胞/T細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)地磷莫司不會引起淋巴細胞/T細胞的凋亡;我們做了克隆無能實驗，外源IL-2(100U/mL)可以恢復(fù)地磷莫司抑制的T細胞的增殖能力，說明克隆無能是地磷莫司誘導(dǎo)免疫耐受的機制之一;通過對T細胞分泌的細胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)，地磷莫司抑制了Th1型細胞因子

7、（IL-2/IFN-γ）的分泌，同時促進了Th2型細胞因子（IL-4）的分泌和TGF-β的分泌;體內(nèi)實驗中，地磷莫司可以延長小鼠同種異體胰島移植模型/小鼠同種異體心臟移植模型中移植物生存期;由HE切片/生存期我們得出，地磷莫司可以抑制炎癥因子浸潤、保護移植物，從而延長生存期;由混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗我們得到，地磷莫司可以抑制經(jīng)過胰島移植/心臟移植后的淋巴細胞/T細胞供體特異性免疫應(yīng)答活性，我們通過CFSE染色的方法得到地磷莫司可以同時抑制

8、CD4+T細胞與CD8+T細胞供體特異性抗原刺激的增殖活性;我們對移植術(shù)后的受體小鼠的脾臟T細胞亞群細胞比例的檢測得出，地磷莫司抑制了受體小鼠脾臟中CD4+T細胞比例，抑制了受體小鼠脾臟中CD8+T細胞比例，升高了受體小鼠體內(nèi)CD19+B細胞比例;對受體小鼠脾臟/淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細胞比例的分析得到，地磷莫司可以同時提高小鼠脾臟/淋巴結(jié)中調(diào)節(jié)性T細胞比例;對于受體小鼠血清中細胞因子IL-2/IL-4/IFN-γ/TGF-β的ELISA檢測

9、可以得出，地磷莫司抑制了受體小鼠血清中細胞因子IL-2/IFN-γ的分泌，提高了受體小鼠血清中細胞因子IL-4/TGF-β的分泌。
　　結(jié)論:通過本課題的研究，我們首次證實了地磷莫司具有免疫抑制作用，可通過抑制增殖，誘導(dǎo)克隆無能，抑制T亞群細胞比例，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞，抑制Th1型細胞分子的分泌，促進Th2型細胞分子的分泌等機制減少移植物炎性細胞浸潤，保護移植物，延長同種異體胰島移植/心臟移植移植物生存期。本課題的研究為地磷莫司應(yīng)用