多孔絲素蛋白膜材料的血管化進(jìn)程研究.pdf

1、多孔絲素蛋白膜(PSFFs)是具有良好的機(jī)械性能和理化性質(zhì)，如柔韌性和抗拉伸強(qiáng)度、降解性、有效的血管化能力等，所以在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用于人造血管、皮膚、骨來(lái)代替、修補(bǔ)、輔助修復(fù)人體組織器官。利用多孔絲素蛋白膜輔助修復(fù)真皮時(shí)，必然要求能夠快速有效地血管化，而多孔絲素蛋白膜血管化過(guò)程是多孔絲素蛋白膜材料、細(xì)胞因子、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等因素相互協(xié)調(diào)作用和適應(yīng)的過(guò)程。但是生物材料中血管新生的細(xì)節(jié)及至材料與機(jī)體組織協(xié)同作用的的創(chuàng)傷環(huán)境條件下血管化的詳細(xì)

2、過(guò)程相關(guān)的研究報(bào)告也比較少。
　　 為了探討多孔絲素蛋白膜材料應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)中的血管化機(jī)制，需要對(duì)材料植入體內(nèi)時(shí)血管化相關(guān)的組織細(xì)胞與微環(huán)境在組織學(xué)和分子生物學(xué)水平上探討與研究。本研究以多孔絲素蛋白膜材料在創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)血管化進(jìn)程的動(dòng)態(tài)觀察作為研究研究目標(biāo)。通過(guò)對(duì)多孔絲素蛋白膜材料血管化過(guò)程的超微觀察分析、血管化有關(guān)分子如HIF、VEGF、整合素αvβ3和血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34等免疫組化分析，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增結(jié)合技術(shù)(RT-PCR

3、)等手段對(duì)絲蛋白生物材料植入大鼠真皮層以后的血管化相關(guān)因子HIF、VEGF及受體、Ang-1的行為趨勢(shì)等進(jìn)行觀察與分析，以期探究材料與組織共存情況下的血管新生過(guò)程的真實(shí)面貌，從而在分子水平和免疫組化水平對(duì)多孔絲素蛋白膜材料血管化過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)研究。
　　 研究的內(nèi)容主要分為以下三個(gè)部分：
　　 第一部分為毛細(xì)血管形態(tài)學(xué)變化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)跟蹤研究及結(jié)果。這部分的工作采用蘇木素伊紅(HE)染色從組織形態(tài)學(xué)上對(duì)血管形成過(guò)程和模式進(jìn)行

4、分析，并用透射電鏡的方法從超微結(jié)構(gòu)分析內(nèi)皮細(xì)胞形成的毛細(xì)血管成熟過(guò)程進(jìn)行觀察，并對(duì)血管新生模式進(jìn)行分析。結(jié)果說(shuō)明了多孔多孔絲素蛋白膜材料內(nèi)的血管化過(guò)程是血管網(wǎng)從無(wú)到有，再?gòu)挠薪?jīng)調(diào)整到優(yōu)化、合理的血管網(wǎng)的過(guò)程以及內(nèi)皮細(xì)胞從少到多，形成新生毛細(xì)血管成熟的生長(zhǎng)階段。手術(shù)7天后多孔多孔絲素蛋白膜材料周圍血管主要以出芽方式侵入材料，內(nèi)皮細(xì)胞周圍沒(méi)有完整的基底膜；25天后主要是血管網(wǎng)形成，以套疊方式優(yōu)化血管，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞連接緊密、基底膜完整。在

5、利用多孔絲素蛋白膜材料進(jìn)行真皮創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中，植入早期血管主要以出芽方式新生，而隨著修復(fù)過(guò)程的進(jìn)行，血管新生方式中出芽方式逐漸減少，而套疊方式逐漸增多，創(chuàng)傷修復(fù)后期毛細(xì)血管主要以套疊方式新生。
　　 第二部分為毛細(xì)血管新生過(guò)程的免疫組化實(shí)驗(yàn)跟蹤研究及結(jié)果。這部分的工作通過(guò)制備創(chuàng)傷動(dòng)物模型，以免疫組化的方法研究HIF、VEGF、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34、整合素avβ3和纖維連接蛋白(FN)、層連接蛋白(LN)在PSFFs和PVA

6、創(chuàng)傷修復(fù)中表達(dá)的時(shí)相性變化，對(duì)他們定位、定性和定量研究，并對(duì)他們的變化趨勢(shì)分析，從而進(jìn)一步探討多孔絲素蛋白膜材料中的創(chuàng)傷修復(fù)和血管化的分子機(jī)制。按照統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明手術(shù)1天時(shí)，多孔絲素蛋白膜和PVA材料里的內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)陰性，材料里充滿成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞；手術(shù)7天，15天，25天時(shí)PSFFs中微血管密度(MVD)值分別是3.54，11.6，24.5，與PVA中的MVD值比較，統(tǒng)計(jì)分析二者具有顯著差異(P<0.05)。PSFFs

7、中的VEGF在手術(shù)1天、7天、15天和25天分值分別是3.4，1.9，2.5，2.6。和PVA相比在手術(shù)7天時(shí)具有顯著差異(P<0.05)，其他時(shí)間段差異不顯著(P>0.05)；手術(shù)1天、7天、15天和25天PSFFs中HIF表達(dá)分別是12，4.8，8.6，9.0，和PVA相比在1天、15天和25天二者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，在手術(shù)7天時(shí)具有顯著差異(P<0.05)。另外本章還研究了血管出芽的標(biāo)記物整合素avβ3、細(xì)胞外基質(zhì)的

8、主要成分FN和基底膜LN的變化趨勢(shì)。得出PSFFs的血管化過(guò)程遵循創(chuàng)傷修復(fù)血管形成的一般特點(diǎn)，但也體現(xiàn)了自己的優(yōu)越性，加快了修復(fù)過(guò)程。PSFFs比PVA具有良好的血管化能力，并且有利于細(xì)胞入侵、血管新生、細(xì)胞外基質(zhì)的重建，從而使組織修復(fù)達(dá)到良好的效果。另外此結(jié)果對(duì)血管在多孔絲素蛋白材料中的生長(zhǎng)模型進(jìn)行了完善。
　　 第三部分為以分子生物學(xué)的方法對(duì)毛細(xì)血管新生過(guò)程相關(guān)分子，生長(zhǎng)因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)跟蹤研究及結(jié)果。這部分的工作通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄－聚

9、合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法對(duì)VEGF及受體、Ang-1、整合素、HIF進(jìn)行擴(kuò)增，觀察他們?cè)?個(gè)時(shí)間段的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示VEGF、HIF和整合素的變化趨勢(shì)和免疫組化結(jié)果一致。PSFFs植入活體后血管形成相關(guān)分子為適應(yīng)環(huán)境發(fā)生了相關(guān)的改變。
　　 通過(guò)以上三部分內(nèi)容的研究，對(duì)多孔絲素蛋白膜材料植入實(shí)驗(yàn)中的血管形成過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)觀察分析與研究，通過(guò)與對(duì)照材料PVA實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，確認(rèn)了絲素蛋白膜材料在創(chuàng)傷修復(fù)中提供有利于毛細(xì)血管

10、新生的正常生理微環(huán)境；在毛細(xì)血管形成中各種相關(guān)因子的動(dòng)態(tài)過(guò)程檢測(cè)或是毛細(xì)血管形態(tài)數(shù)量變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都顯示了與PVA材料有顯著性差異。
　　 研究觀察到在多孔絲素蛋白膜植入體內(nèi)的血管新生過(guò)程中，修復(fù)進(jìn)程前期主要以出芽方式新生、后期主要以套疊新生。在絲素蛋白材料中看到這一現(xiàn)象，為這一現(xiàn)象在新的條件下的再現(xiàn)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 對(duì)多孔絲素膜蛋白材料血管化過(guò)程，首先通過(guò)對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)進(jìn)程進(jìn)行組織學(xué)和透射電鏡的顯微追蹤觀察；其次通過(guò)免