淡水魚肌肉亮氨酸氨肽酶的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、本文首次以鯉魚、草魚、鰱魚三種典型的淡水魚為原料，對(duì)其肌肉亮氨酸氨肽酶進(jìn)行分離純化，并研究了它們的酶學(xué)性質(zhì)，為LAP在魚類肌肉中的生理學(xué)功能研究提供理論依據(jù)。 本文采用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-Sephacel離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析、Phenyl Sepharose 6-Fast Flow疏水層析和 Econo-Pac Macro-Prep High Q離子交換層析等方法，從鯉魚

2、、草魚、鰱魚肌肉中分離純化得到LAP，分別命名為cmLAP(鯉魚)，gmLAP(草魚)和smLAP(鰱魚)。 SDS-PAGE和凝膠過濾結(jié)果表明，純化的cmLAP、gmLAP和smLAP都是單體結(jié)構(gòu)，分子量約為105 kDa。三者的最適反應(yīng)溫度為35-40℃，熱穩(wěn)定性較差，最適pH為7.0-7.5。金屬螯合劑EDTA，EGTA和1,10-phenanthroline能有效抑制其活性，而其它抑制劑沒有明顯抑制作用，說明三者都是金屬

3、蛋白酶。Bestatin，一種選擇性抑制氨肽酶的蛋白酶抑制劑對(duì)三者有強(qiáng)烈抑制作用。金屬離子對(duì)三種LAP作用存在細(xì)微的差別，但總體看來，Mg2+和Mn2+有輕微的激活作用，Co2+，Cu2+，Zn2+對(duì)酶都有不同程度的抑制作用。另外，巰基試劑對(duì)于保持酶活性是必不可少的。除了 Leu-MCA，酶對(duì)其它很多種氨基酸殘基也有一定分解作用，而對(duì)內(nèi)肽酶對(duì)應(yīng)的熒光底物和大分子量天然蛋白如肌原纖維蛋白和牛血清白蛋白沒有分解作用。以 Leu-MCA為底物