牙鲆肌肉賴氨酸氨肽酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、賴氨酸氨肽酶(lysineaminopeptidase，LysAP)是一類對(duì)賴氨酸殘基切割效率最高的氨肽酶。作為必需氨基酸，賴氨酸可以調(diào)節(jié)人體代謝平衡，提高鈣的吸收以及在體內(nèi)的積累，加速骨骼生長(zhǎng)；促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、增加食欲和增強(qiáng)體質(zhì)等作用。LysAP的切割特性決定了其酶解產(chǎn)物為游離氨基酸和小肽，而游離氨基酸和小肽對(duì)于食品風(fēng)味的組成有重要意義。魚體死亡后，體內(nèi)的各種內(nèi)切酶將肌肉蛋白降解為小肽，氨肽酶對(duì)肽鏈進(jìn)行進(jìn)一步降解，釋放出游離氨基酸，導(dǎo)致

2、肌肉嫩化，風(fēng)味改善。另外，LysAP可以切除苦味肽氮端的疏水氨基酸殘基從而脫除苦味，因而受到食品加工等行業(yè)的廣泛關(guān)注。
　　 本文以海水魚牙鲆為研究對(duì)象，通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sephaccel陰離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析及DEAE-Sepharose陰離子交換層析等步驟從牙鲆肌肉中分離純化得到目的蛋白酶，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了分析研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 1)從300g牙鲆肌肉中分離純化得到

3、1.2mg目的蛋白酶，純化倍數(shù)為2249.7，得率為19.7％。肽質(zhì)量指紋圖譜結(jié)果表明，該酶屬于氨肽酶。底物特異性實(shí)驗(yàn)表明，該酶對(duì)賴氨酸殘基的熒光合成底物的分解效率最高，所以命名為賴氨酸氨肽酶(LysAP)。
　　 2)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果顯示，純化得到的牙鲆LysAP為單體結(jié)構(gòu)，分子量為100kDa左右。通過雙向電泳(2D-PAGE)檢測(cè)純化的LysAP，得到單一的點(diǎn)，該酶的等電點(diǎn)為5.7。

4、>　　 3)牙鲆LysAP的最適反應(yīng)溫度為45℃，熱穩(wěn)定性較差。通過熱失活動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定該酶表觀熱失活速度常數(shù)可知，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)速度提高，同時(shí)酶失活所需要的時(shí)間也變短。牙鲆LysAP最適反應(yīng)pH為7.5，在中性或弱堿性范圍內(nèi)酶活力較高，同時(shí)酶也較穩(wěn)定。
　　 4)牙鲆LysAP對(duì)賴氨酸殘基分解效率最高。該酶對(duì)疏水氨基酸殘基的切割效率較高。這一特性對(duì)于該酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重要的意義。另外，該酶不

5、具有內(nèi)肽酶活性。
　　 5)利用雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算求得分別以Lys-MCA、Leu-MCA、Arg-MCA等為底物時(shí)牙鲆LysAP動(dòng)力學(xué)參數(shù)，牙鲆LysAP對(duì)這三種底物的kcat/Km分別為7.2、6.8、4.6(μM-1·S-1)。根據(jù)Arrhenius公式計(jì)算得到該酶的活化能(Ea)為72.5kJ/mol。
　　 6)EDTA、EGTA和1，10-phenanthroline三種金屬螯合劑均能有效地抑制牙鲆LysAP

6、的活性，說明該酶屬于金屬蛋白酶。特異性針對(duì)氨肽酶的抑制劑Bestatin能夠很強(qiáng)地抑制其活性，表明該酶屬于氨肽酶。
　　 7)不同的二價(jià)金屬離子對(duì)LysAP的作用不同。Zn2+、Mn2+均可將LysAP經(jīng)EDTA透析喪失的酶活性幾乎完全恢復(fù)。表明該酶屬于結(jié)合Zn2+和(或)Mn2+的金屬蛋白酶。
　　 8)利用抗真鯛亮氨酸氨肽酶(LeuAP)多克隆抗體的免疫交叉反應(yīng)表明，牙鲆LysAP與真鯛亮氨酸氨肽酶具有很高的同源性，