脈動(dòng)生物反應(yīng)器的研制、測(cè)試和初步試用.pdf

1、心臟瓣膜病是危害人類健康的重要疾病，人工心臟瓣膜置換術(shù)是心臟瓣膜病的重要治療方法。臨床上目前使用的人造心臟瓣膜主要有機(jī)械瓣和生物瓣,但都有其各自的缺點(diǎn)，機(jī)械瓣存在要終生抗凝、潛在性的出血、血栓形成、栓塞等問(wèn)題；生物瓣則易鈣化、變性以致衰敗失去功能。組織工程心臟瓣膜是利用有生物活性的細(xì)胞種植于支架材料之上,使得該瓣膜在植入人體后仍能保持生物活性,能隨機(jī)體的發(fā)育而生長(zhǎng),較現(xiàn)有的機(jī)械瓣和生物瓣更加理想。隨著組織工程心臟瓣膜的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)

2、體外構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜在置入人體內(nèi)無(wú)法經(jīng)受住體內(nèi)高速血流的沖擊，表面的內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力差，易脫落。因此體外構(gòu)建脈動(dòng)生物反應(yīng)器，讓TEHV在體外脈動(dòng)流體條件下預(yù)適應(yīng)，從而提高TEHV耐受體內(nèi)血流沖擊的作用。由于目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)完善的脈動(dòng)生物反應(yīng)器可供使用，都處于實(shí)驗(yàn)階段。因此，本研究自行研制脈動(dòng)生物反應(yīng)器。并進(jìn)行了相關(guān)的測(cè)試。然后，將內(nèi)皮祖細(xì)胞和去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜構(gòu)建的組織工程心臟瓣葉（THEV）置入脈動(dòng)生物反應(yīng)器中進(jìn)行預(yù)適應(yīng)，觀察瓣葉

3、表面細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，探討脈動(dòng)生物反應(yīng)器在TEHV構(gòu)建中的應(yīng)用。
　　第一部分：脈動(dòng)生物反應(yīng)器的構(gòu)建和性能測(cè)試
　　(1)脈動(dòng)生物反應(yīng)器的構(gòu)建包括兩個(gè)部分：動(dòng)力部分和流體培養(yǎng)部分。動(dòng)力部分是有我們自行構(gòu)建的能夠周期性的排出和吸入空氣的動(dòng)力裝置。流體培養(yǎng)部分是由幾部分組成，心室輔助裝置：連接動(dòng)力部分與流體培養(yǎng)部分。瓣膜培養(yǎng)腔：由聚碳酸酯合成的管狀培養(yǎng)腔，中間的瓣架可以固定瓣膜。還有儲(chǔ)液罐，也由聚碳酸酯材料制成，各個(gè)部分由醫(yī)用硅膠

4、管道連接而成。整個(gè)流體培養(yǎng)部分置入細(xì)胞培養(yǎng)箱，處于37℃，含5％CO2和95％空氣的培養(yǎng)環(huán)境中。
　　(2)脈動(dòng)生物反應(yīng)器性能測(cè)試。
　?、贆C(jī)械穩(wěn)定性的測(cè)試?yán)闷胀ㄉ锇曜鲈囼?yàn)瓣膜，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5天，觀察脈動(dòng)生物反應(yīng)器的機(jī)械穩(wěn)定性，共檢測(cè)3次。觀察各個(gè)連接部位對(duì)合是否緊密，是否漏液。觀察能否產(chǎn)生搏動(dòng)性液體，瓣膜能否具有正常的開閉功能。
　?、诳刮廴拘阅軝z測(cè)：采用LB培養(yǎng)基做灌注液，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5天，觀察培養(yǎng)液有無(wú)混濁，共檢測(cè)3

5、次。光鏡觀察LB培養(yǎng)基有無(wú)細(xì)菌或霉菌污染，同時(shí)行營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和霉菌瓊脂培養(yǎng)基涂板試驗(yàn)。
　?、蹣?gòu)建材料的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：用構(gòu)建瓣膜培養(yǎng)腔和儲(chǔ)液罐的聚碳酸酯材料浸提液、醫(yī)用硅膠管道的浸提液與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞的相對(duì)增值率（MTT法檢測(cè)）來(lái)判斷材料的體外細(xì)胞毒性分級(jí)。以檢測(cè)材料能否作為構(gòu)建培養(yǎng)細(xì)胞脈動(dòng)生物反應(yīng)器而被安全使用。
　　④流體力學(xué)性能檢測(cè)：以生物瓣做試驗(yàn)瓣膜，運(yùn)行脈動(dòng)生物反應(yīng)器，進(jìn)行流體力學(xué)性能檢測(cè)。

6、在不同工作狀況下，測(cè)試脈動(dòng)生物反應(yīng)器的流量，通過(guò)壓力傳感器測(cè)脈動(dòng)反應(yīng)器內(nèi)通過(guò)生物瓣液體的壓力。
　　結(jié)果：
　　(1)構(gòu)建的脈動(dòng)生物反應(yīng)器性能動(dòng)力系統(tǒng)：自行研制的脈動(dòng)生物反應(yīng)器動(dòng)力裝置，工作穩(wěn)定，收縮壓0-250mmHg，舒張壓-100-100mmHg。輸出心率0-90次/分.流體培養(yǎng)系統(tǒng)：瓣膜培養(yǎng)腔可以較好的固定瓣膜。儲(chǔ)液瓶容積1000ml左右，可以滿足儲(chǔ)液要求。
　　(2)采用生理鹽水做灌注液，脈動(dòng)反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5

7、天，檢測(cè)3次，未有液體滲漏，機(jī)械狀態(tài)穩(wěn)定，未見異常。大體觀察見可產(chǎn)生搏動(dòng)性液體，隨動(dòng)力裝置調(diào)節(jié)壓力和流量也隨之變化。生物瓣具有正常的開、閉功能,瓣葉活動(dòng)自如。
　　用LB培養(yǎng)基灌注液運(yùn)轉(zhuǎn)5天，檢測(cè)3次，未見培養(yǎng)液混濁，光鏡觀察未見細(xì)菌和霉菌污染。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和霉菌瓊脂培養(yǎng)基涂板試驗(yàn)陰性。
　　采用構(gòu)建脈動(dòng)生物反應(yīng)器的材料浸提液與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)，相對(duì)增值率均大于95％，結(jié)果證明材料對(duì)細(xì)胞毒性為1級(jí)，毒性較低，可用

8、于細(xì)胞的體外培養(yǎng)。
　　流體力學(xué)性能檢測(cè)可見脈動(dòng)生物反應(yīng)器能夠產(chǎn)生搏動(dòng)性液體，流量0-3500ml/min，壓力0-120mmHg，頻率0-90次/分。流體力學(xué)參數(shù)說(shuō)明其能夠模擬體內(nèi)心臟瓣膜的流體力學(xué)特性。
　　第二部分：脈動(dòng)生物反應(yīng)器在TEHV構(gòu)建中的初步試用
　　(1)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。
　　(2)采用胰酶、去污劑Triton-X100、核酸酶進(jìn)行豬主動(dòng)脈瓣膜的脫細(xì)胞處理，通過(guò)組織切片、掃描電鏡檢

9、查觀察脫細(xì)胞效果。
　　(3)采用去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣葉做支架材料，人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞做種子細(xì)胞，體外靜態(tài)構(gòu)建TEHV。于構(gòu)建的第7天通過(guò)瓣葉組織切片、免疫細(xì)胞染色、掃描電鏡等觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　(4)靜態(tài)構(gòu)建的TEHV前體在脈動(dòng)生物反應(yīng)器中的初步應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分3組，每組6個(gè)瓣葉。靜態(tài)對(duì)照組：靜態(tài)構(gòu)建的TEHV，未經(jīng)過(guò)流體作用；高流量培養(yǎng)組：靜態(tài)構(gòu)建的TEHV置入反應(yīng)器內(nèi)，直接給予1500ml/min培養(yǎng)。脈動(dòng)流預(yù)

10、適應(yīng)組：靜態(tài)構(gòu)建的TEHV置入反應(yīng)器內(nèi)，起始流量100ml/min,以200ml/d的速度增加流量,培養(yǎng)8日至1500ml/min。于第8日剪取瓣葉行HE染色、掃描電鏡觀察細(xì)胞在瓣葉上的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)出外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞，且生長(zhǎng)狀況良好。采用已有去細(xì)胞方法可完全去除豬主動(dòng)脈瓣葉的細(xì)胞成分，且膠原纖維保存完好，掃描電鏡見去細(xì)胞瓣膜表面細(xì)胞去除干凈。構(gòu)建的組織工程瓣膜，光鏡下觀察,可見瓣葉表面有內(nèi)皮細(xì)胞緊貼表面生長(zhǎng),在瓣

11、葉纖維層面,內(nèi)皮細(xì)胞順著凹凸不平的表面基本形成一層連續(xù)細(xì)胞層,但細(xì)胞并未向瓣葉基質(zhì)內(nèi)部長(zhǎng)入，免疫組化和免疫熒光染色見去細(xì)胞瓣葉的表面細(xì)胞層著色。脈動(dòng)流培養(yǎng)后，見經(jīng)過(guò)脈動(dòng)流預(yù)適應(yīng)組殘留的細(xì)胞要明顯多于直接高流量培養(yǎng)組（0.132±0.013vs0.648±0.036,P<0.05），且細(xì)胞之間，細(xì)胞與支架之間連接緊密。
　　結(jié)論：
　　自行設(shè)計(jì)的脈動(dòng)反應(yīng)器動(dòng)力裝置壓力和頻率基本上能夠滿足需求。流體培養(yǎng)系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定，瓣膜固定方便

12、，總體來(lái)說(shuō)，成功構(gòu)建了可以初步使用的脈動(dòng)生物反應(yīng)器。脈動(dòng)生物反應(yīng)器能夠模擬在體心臟瓣膜的流體力學(xué)特征，產(chǎn)生搏動(dòng)性液體，具有較好的機(jī)械穩(wěn)定性和抗污染性能；構(gòu)建材料細(xì)胞毒性很低，可用于細(xì)胞培養(yǎng)的試驗(yàn)研究。
　　外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞在去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣上生長(zhǎng)良好，可以作為構(gòu)建TEHV的種子細(xì)胞。將種植內(nèi)皮祖細(xì)胞的去細(xì)胞豬瓣葉置入脈動(dòng)生物反應(yīng)器中進(jìn)行研究，當(dāng)經(jīng)過(guò)脈動(dòng)應(yīng)力預(yù)適應(yīng)處理后，瓣葉表面殘留的細(xì)胞要明顯多于未經(jīng)預(yù)適應(yīng)處理組，且細(xì)胞細(xì)胞之間、