血管內(nèi)皮細胞生物反應器構(gòu)建的初步研究.pdf

1、目的：生物反應器是一個由具有內(nèi)在網(wǎng)絡(luò)通道的聚合物構(gòu)成的立體框架結(jié)構(gòu),同時輔以流動的培養(yǎng)液提供營養(yǎng)。通道內(nèi)外相隔一層半透膜,這樣便為大量有效地培養(yǎng)細胞并使之發(fā)揮功能提供了條件。生物反應器在生物型人工肝臟的應用已有30多年的歷史。自從1972年Knazek設(shè)計了中空纖維生物反應器,1975年Wolf等人將其應用于肝細胞的培養(yǎng)后,生物反應器在人工肝上的應用不斷進展。除此之外,中空纖維生物反應器也被應用于人工腎小管輔助裝置的構(gòu)建,研究者在采用該

2、裝置治療急性腎功能衰竭和膿毒癥的過程中,發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞可通過調(diào)節(jié)機體炎癥反應水平影響膿毒癥的預后。
　　 膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征,具有發(fā)病率和死亡率高、治療效果差等特點。在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中,內(nèi)皮細胞無論是形態(tài)還是功能上均受到嚴重的損害,而內(nèi)皮細胞的損害又進一步加重了膿毒癥時的炎癥和凝血。那么,采用細胞療法體外替代內(nèi)皮細胞的功能是否能改善膿毒癥的預后呢?基于此設(shè)想,本課題通過在中空纖維生物反應器的外腔種植內(nèi)

3、皮細胞,構(gòu)建內(nèi)皮細胞生物反應器,并對內(nèi)皮細胞的形態(tài)和生物活性進行鑒定,以期為膿毒癥的治療提供一項新的手段。
　　 方法：
　　 本實驗分為三部分:
　　 1、局部試驗,探討內(nèi)皮細胞能否在聚砜膜中空纖維的外表面生長。首先將聚砜膜中空纖維纏繞于蓋玻片上制成聚砜膜片,環(huán)氧乙烷滅菌處理,生理鹽水清洗,然后將其置于培養(yǎng)皿中。加入培養(yǎng)液和內(nèi)皮細胞,觀察內(nèi)皮細胞在聚砜膜中空纖維外表面的生長情況。
　　 2、無紡布內(nèi)皮細

4、胞生物反應器的構(gòu)建。先用生理鹽水對反應器的內(nèi)腔和外腔進行預沖,再將內(nèi)皮細胞懸液植入其外腔,封閉外腔口；內(nèi)腔與培養(yǎng)液循環(huán)式人工毛細管培養(yǎng)系統(tǒng)相連接,采用含10％胎牛血清和“雙抗”的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。管路連接后將整個裝置置于5％C02、37℃培養(yǎng)箱中孵育。定時取反應器內(nèi)腔培養(yǎng)液,用于乳酸、葡萄糖、一氧化氮、蛋白C和vWF的檢測。內(nèi)皮細胞在生物反應器外腔生長5d后,剖開反應器外殼,取出其中的無紡布,行光鏡、熒光顯微鏡和電鏡檢查,

5、觀察內(nèi)皮細胞在無紡布上的生長情況。
　　 3、微載體內(nèi)皮細胞生物反應器的構(gòu)建。首先對微載體進行水化膨脹、高壓滅菌處理,然后與內(nèi)皮細胞共同置于75cm2的培養(yǎng)瓶中,加入含10％胎牛血清和“雙抗”的DMEM高糖培養(yǎng)液,間斷振蕩培養(yǎng)。待內(nèi)皮細胞長滿微載體表面后,行光鏡、熒光顯微鏡和電鏡檢查,觀察內(nèi)皮細胞在微載體上的生長情況。然后將長滿內(nèi)皮細胞的微載體移入生物反應器的外腔,封閉外腔口,內(nèi)腔與培養(yǎng)液循環(huán)式人工毛細管培養(yǎng)系統(tǒng)相連接(同無紡布

6、內(nèi)皮細胞生物反應器的構(gòu)建),采用無血清、含“雙抗”的DEME高糖培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。定時取反應器內(nèi)腔培養(yǎng)液,用于乳酸和葡萄糖的檢測。
　　 結(jié)果
　　 1、局部試驗:
　　 光鏡、熒光顯微鏡下,聚砜膜中空纖維側(cè)面光滑,未見內(nèi)皮細胞貼附、生長。在同一培養(yǎng)皿中,內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好。
　　 2、無紡布內(nèi)皮細胞生物反應器的構(gòu)建:
　　 熒光顯微鏡下,無紡布由長短不一的絲狀物不規(guī)則交織而成,絲狀物表面可見大量

7、內(nèi)皮細胞貼附,密度均勻,細胞核有的呈橢圓形,有的呈細長形,部分細胞可見雙核,增值明顯,罕見濃縮、碎裂的細胞核。電鏡下,內(nèi)皮細胞貼附于無紡布纖維絲的表面,大部分細胞伸出觸角,具有良好的內(nèi)皮細胞的形態(tài)。
　　 培養(yǎng)液中乳酸的濃度隨時間變化進行性升高,升高的速度逐漸加快,換液時濃度下降；葡萄糖的濃度則進行性降低,降低的速度逐漸加快,換液時,濃度上升；NO濃度在最初數(shù)小時內(nèi)有所降低,之后進行性升高。
　　 內(nèi)皮細胞在反應器內(nèi)生長

8、5d后取出反應器外腔的培養(yǎng)液,離心后,內(nèi)皮細胞數(shù)量很少。將內(nèi)皮細胞種植于培養(yǎng)瓶中,2d后觀察內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好,無污染。反應器構(gòu)建120h(即構(gòu)建結(jié)束)時取反應器外腔培養(yǎng)液進行vWF、蛋白C的檢測,發(fā)現(xiàn)前者可檢測得出,但后者低于檢測范圍。
　　 3、微載體內(nèi)皮細胞生物反應器的構(gòu)建
　　 光鏡下,內(nèi)皮細胞長滿微載體表面,微載體表面凹凸不平。熒光纖維鏡下,內(nèi)皮細胞核貼附于微載體表面,分布均勻,罕見濃縮、碎裂的細胞核。電鏡下