基于紙片保存奶樣的奶牛隱性乳腺炎診斷技術(shù)研究.pdf

1、本文從奶牛隱性乳腺炎的流行病學(xué)、影響紙片保存奶樣中乳糖、乳蛋白等生化指標(biāo)測定的因素、紙片保存奶樣中無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌的PCR檢測方法及其適用性進(jìn)行了探索、最后對牛奶蛋白的SDS-PAGE電泳在隱性乳腺炎診斷的應(yīng)用作了探討，并對各種方法與標(biāo)準(zhǔn)診斷方法進(jìn)行了比較分析。 對杭州等地4388份奶樣體細(xì)胞計數(shù)值與季節(jié)、奶產(chǎn)量、泌乳周期、乳脂和脂蛋白等因素的關(guān)系進(jìn)行了調(diào)查，利用限制性最大似然估計(REML)模型進(jìn)行了分析，結(jié)果表明采

2、樣月份(F=8.83，p<0.01)、日奶產(chǎn)量(F=212.12，p<0.01)、胎次(F=16.86，p<0.01)、乳脂率(F=71.87，p<0.01)、乳蛋白(F=78.92，p<0.01)等因素對奶樣體細(xì)胞數(shù)均有顯著影響。利用混合線性模型的最大似然估計(REML)方法建立了體細(xì)胞計數(shù)響應(yīng)模型，該模型可以有效地預(yù)測體細(xì)胞數(shù)的變化規(guī)律。在此基礎(chǔ)上利用Logistic回歸模型分析了采樣月份、胎次、泌乳周期和日產(chǎn)奶量等因素對隱性乳腺炎

3、發(fā)病率的影響程度，建立了相應(yīng)的預(yù)測模型，經(jīng)共線性檢驗，模型預(yù)測值與原始數(shù)據(jù)吻合良好(p>0.05)模型分析提示，每年的8-9月份體細(xì)胞水平顯著升高(p<0.05)。日產(chǎn)奶量在20-30 kg，乳脂率在3.5-5.0％，蛋白含量在2.5-3.1％時奶牛隱性乳腺炎發(fā)病機(jī)率最低。 紙片保存奶樣中乳糖含量的變異系數(shù)略大于液態(tài)奶樣，但乳糖水平無顯著差異(t=0.389，p>0.05)。保存期(F=1.004，p>0.05)、保存溫度(F=

4、0.004，p>0.05)對紙片保存奶樣的乳糖水平?jīng)]有顯著影響，其乳糖含量僅受奶樣本身體細(xì)胞數(shù)的影響(F=162.42，p<0.01)。提示紙片保存奶樣適用于進(jìn)行牛奶乳糖指標(biāo)的測定。 紙片保存奶樣的蛋白含量約為液態(tài)奶樣的83.6％，其變異系數(shù)為4.41％。保存時間和預(yù)處理介質(zhì)對紙片保存奶樣蛋白含量有顯著影響(p<0.01)，并受牛奶體細(xì)胞數(shù)的影響(p<0.05)。保存溫度對其影響不顯著(p<0.052)。保存時間和預(yù)處理介質(zhì)對紙

5、片保存奶樣的蛋白水平有協(xié)同影響(p<0.01)。初始值和保存1、2、4周的樣品間均有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p<0.05)；隨著時間的延長，樣品中蛋白含量逐漸下降，DDW、Tris鹽酸緩沖液預(yù)處理對紙片保存奶樣蛋白水平均有顯著影響，EDTA對測定結(jié)果沒有顯著影響(p<0.05)。提示紙片保存奶樣蛋白質(zhì)含量稍有下降，但在1-4周內(nèi)可以保持相對穩(wěn)定。 對人工污染無乳鏈球菌的紙片奶樣進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，結(jié)果表明，紙片預(yù)處理介質(zhì)(p<0.01)和保存

6、期(p<0.01)對紙片保存無乳鏈球菌復(fù)蘇率有顯著影響，而保存溫度對結(jié)果的影響較小(p>0.05)。紙片保存溫度(p<0.05)、預(yù)處理方法(p<0.01)和保存期(p<0.01)對金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)成功率有顯著影響。 針對無乳鏈球菌16-23S rRNA基因間區(qū)序列的引物，可擴(kuò)增出唯一的270bp的PCR產(chǎn)物，而對人工污染的金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌的液態(tài)奶和紙片保存樣品均無擴(kuò)增產(chǎn)物形成。該引物對無乳鏈

7、球菌的PCR檢測靈敏度為2×10<'2>cfu/ml，與液態(tài)奶的檢出結(jié)果相似。預(yù)處理方法對PCR結(jié)果沒有顯著影響，所有處理均可獲得滿意的PCR結(jié)果。以細(xì)菌培養(yǎng)為參照，PCR診斷的敏感性為96.15％，特異性為98.60％，準(zhǔn)確率為98.06％，可以有效地從紙片保存樣品中檢出無乳鏈球菌。 金黃色葡萄球菌引物SAISR1和sAISR2可分別從紙片保存樣品中擴(kuò)增出約500bp和250bp的特異性PCR產(chǎn)物，而對人工污染無乳鏈球菌等奶牛

8、隱性乳腺炎主要病原無特異性擴(kuò)增。SAISR1和SAISR2對紙片樣品的檢測靈敏度分別為2×10<'4>CFU/mL和2×10<'3>CFU/mL；若采用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合硝酸銀染色，SAISR2的靈敏度可提高至2×10<'1>CFU/mL。紙片預(yù)處理介質(zhì)對PCR結(jié)果沒有顯著影響。以細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)，SAISR2的靈敏度為89.19％，特異性為98.08％，診斷準(zhǔn)確率96.37％，可有效地從紙片保存奶樣中檢出金黃色葡萄球菌。 利用S

9、DS-PAGE研究了紙片保存奶樣乳蛋白成分變化，分子量較小的成分得到較好的分離(R<,f>>0.2)，呈現(xiàn)為獨(dú)立的條帶群。分子量較大的成分滯留在上樣孔附近，遷移率很小(R<,f><0.2)。遷移率較大的成分主要形成R<,f>值在0.51(A)，0.62(B)，0.72(C)，0.78(D)，0.84(E)和0.98(F)等6個條帶群，其中C、D和E三個條帶群，可因奶樣不同而呈現(xiàn)不同的亮度或缺少，經(jīng)與HMT、SCC和主要病原菌分離培養(yǎng)等試

10、驗結(jié)果聯(lián)合分析，C、D、E三個條帶群與SCC(r=0.795，p<0.01)、HMT(r=0.471，p<0.01)和主要病原菌的存在(r=0.389，p<0.01)有顯著相關(guān)。 與細(xì)菌分離培養(yǎng)對比，SDS-PAGE方法對隱性乳腺炎診斷的靈敏度為100％，特異性為55.56％，若將分離到凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)也計入病原菌，則SDS-PAGE的靈敏度為90％，特異性為70.59％，與細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果高度一致(kappa=0.6