急性百草枯中毒大鼠肺組織p38MAPK、NF-κB、TGF-β-,1-、MMPs、TIMPs的變化及褪黑素的治療作用研究.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范圍內廣泛使用的除草劑。隨著其在我國農業(yè)上的廣泛應用，PQ中毒也日趨增多。PQ 經皮膚接觸、呼吸道及消化道進入體內，造成急性中毒。PQ對人畜均有較強毒性，中毒致死劑量小，口服致死量為30-40mg/kg。PQ中毒病程進展快且目前尚無特效解毒藥物，在臨床上病死率很高，報道可高達80％以上。肺為PQ中毒的主要靶器官，也是百草枯中毒死亡的主要原因。大劑量中毒常由于急性肺損傷所致的呼吸衰竭及心、肝、腎

2、等多臟器功能衰竭而死亡；較小劑量的中毒往往引起遲發(fā)性的肺纖維化，病程相對較長，晚期多死于肺間質纖維化所致的呼吸衰竭。 PQ的肺毒性早期表現(xiàn)為急性肺泡炎，以后表現(xiàn)為進行性加重的肺間質纖維化。PQ引起肺損傷及后期肺纖維化的病理生理機制還未闡明。由于在PQ中毒早期主要表現(xiàn)為急性肺泡炎性改變，因此有多種促炎細胞因子參與其中，p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinasesMAPK)作為MAPK

3、家族的成員，其信號轉導通路在炎性反應性疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要調控作用，能被多種炎性刺激所激活，參與介導細胞應激反應、免疫反應和細胞生長、發(fā)育、分裂、死亡以及細胞問的功能同步等多種過程；而核因子kB(nuclear factor kappaB，NF-kB)是普遍存在于真核細胞中的一個轉錄因子，在炎癥反應的細胞因子網絡調節(jié)中起關鍵作用，最新研究發(fā)現(xiàn)NF-kB可以氧自由基激活，這種活化效應可被抗氧化劑所抑制。近年來研究表明，肺間質纖維化是

4、細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過度沉積造成的，這種過度沉積不僅是由于ECM合成增多，更大程度上是ECM降解減少即合成和降解不平衡引起的。其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其組織抑制因子(tissueinhibitor of metal|oproteinnase，TIMPs)在ECM合成/降解的調節(jié)過程中起著非常重要的作用，而在某些MMPs基因的啟動子區(qū)域存在

5、有NF-kB的結合位點。TGF-β<,1>是參與肺纖維化的細胞因子中研究最深入、作用最重要的因子。它能促進成纖維細胞合成膠原蛋白、纖維連結蛋白、蛋白多糖等細胞外基質，促進細胞外基質的沉積；它還能減少基質降解蛋白酶的產生，增加這些蛋白酶抑制物的水平，因此其在肺纖維化過程中起重要作用。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體分泌的一種吲哚胺類激素，研究發(fā)現(xiàn)MT。具有高親脂性，因此具有高度彌散穿透能力，能在細胞膜、胞漿和細胞核中發(fā)揮抗氧化

6、作用。MT可有效清除化學反應中的氧自由基，亦可抑制過氧化氫引起的過氧化脂質含量的升高，還能增強體內抗氧化酶的活性，故能有效保護生物大分子如脂質、DNA免受自由基損傷，從而對氧自由基的損傷起保護作用。是目前已知的抗氧化作用最強的內源性自由基清除劑。推測MT 能減輕PQ所致組織過氧化損傷和肺纖維化形成。 p38MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs和 TIMPs 在PQ中毒所致肺損傷中的變化以及MT對它們的影響在國內外尚

7、未見報道。本研究試圖通過PQ灌胃染毒制成PQ中毒模型，并給予 MT 作為干預措施，觀察其病情變化及不同時間體內肺組織病理改變，及肺組織中p38 MAPK、NF-kB、TGF-β<,1>、MMPs與TIMPs的表達變化，了解它們在PQ中毒肺損傷中的作用，進一步探討PQ中毒肺損傷的發(fā)病機制及MT對PQ中毒的治療作用。 本實驗共包括三個部分。 第一部分急性百草枯中毒大鼠肺間質改變及其調控機制 目的：觀察PQ中毒大鼠體內

8、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力及肺組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達的變化，探討它們在PQ中毒所致肺組織損傷中的作用。 方法：選擇健康成年SD大鼠48只，隨機分為兩組：對照組(A組)6只，染毒組(B組)42只。B組應用PQ50mg/kg灌胃制作染毒模型；A組生理鹽水(NS)灌胃。分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后

9、開胸，先心臟取血，測定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺組織，測定肺組織勻漿羥脯氨酸含量，采用 RT-PCR 法測定肺組織MMP-2、MMP-9及。TIMP-1 mRNA的表達；另取肺組織行HE染色、Masson染色、免疫組織化學染色及電鏡觀察。A組行同樣處理。 結論：1.百草枯中毒引起的肺損傷主要表現(xiàn)為早期的急性肺泡炎和以后逐漸進展的肺間質纖維化。 2.百草枯中毒大鼠體內MDA含量升高、SOD及GSH

10、-Px 活力下降，說明 PQ 可引起肺內炎性反應，進而產生的過氧化損傷及肺內氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡是造成急性肺損傷的主要機制。 3.百草枯中毒致急性肺損傷后，肺內MMP-2、MMP-9及 TIMP-1 的表達不同步造成ECM合成和降解不平衡，從而誘導肺纖維化形成。 第二部分急性百草枯中毒大鼠肺組織中NF-kB、 TGF-β<,1>及p38MAPK的變化研究 目的：觀察中毒大鼠肺組織中NF-kB活性、TGF-β<,1

11、> 及磷酸化p38MAPK的變化，探討其在急性百草枯中毒所致肺損傷中的作用。 方法：選擇健康成年SD大鼠48只，隨機分為兩組：對照組(A組)6只，染毒組(B組)42只。B組于染毒后1d、3d、7d、14d、21d，28d、35d各取6只大鼠，留取肺組織。采用電泳遷移率改變分析法(EMSA)測定NF-kB 活性，Western blot法測定磷酸化p38MAPK蛋白表達，RT-PCR法測定MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 T

12、GF-β<,1> mRNA 的表達；同時行免疫組織化學觀察。A組行同樣處理。 結論：本研究顯示，中毒大鼠肺組織中NF-kB、p38MAPK及TGF-β<,1>表達均明顯增強，與MMPs/TIMPs的異常表達及比例失衡密切相關。它們之間相互作用，互為因果，參與了肺組織的炎性損傷、組織結構破壞以及隨后的組織修復過程，從而引起肺組織損傷和肺纖維化形成。其中NF-kB和p38MAPK在中毒早期表達增強，可能在肺泡炎階段起重要作用；而TG

13、F-β<,1>在中毒后期仍維持高水平，與TIMP的變化一致，可能在纖維化形成過程中發(fā)揮更為關鍵的作用。 第三部分褪黑素治療急性百草枯中毒大鼠肺損傷的分子機制研究 目的：觀察褪黑素(MT)對染毒大鼠體內MDA、 SOD、GSH-Px活力及肺組織MMPs、TIMPs、NF-kB、TGF-β<,1>及p38MAPK 表達的影響，探討MT對急性百草枯中毒的治療效果。 方法：選擇健康成年SD大鼠90只，隨機分為三組：①對照

14、組(A組)6只；②染毒組(B組)42只；③MT治療組(C組)42只：PQ灌胃染毒后，給予MT10mg/kg腹腔注射，每日一次；A組和B組每日給予等量NS腹腔注射。分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取6只大鼠，氯胺酮麻醉后開胸，先心臟取血，測定血清MDA、SOD及GSH-Px活力；而后迅速留取肺組織，測定肺組織勻漿羥脯氨酸含量；采用RT-PCR 法測定肺組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1及 TGF-β<,

15、1> mRNA 的表達；電泳遷移率改變分析法(EMSA)測定NF-KB活性；采用Westem blot法測定磷酸化p38MAPK蛋白表達；另取肺組織行HE染色、Masson染色及免疫組織化學染色。A組行同樣處理。 結論：應用MT治療，可明顯降低百草枯中毒大鼠血清MDA含量，增加SOD及GSH-Px活力；減輕染毒大鼠肺組織早期的炎性改變及后期的肺纖維化趨勢，這可能與MT較強的抗氧化功能以及降低肺組織NF-kB活性，減少TGF-β<