PON1基因過表達對急性敵敵畏中毒小鼠膈肌細胞損傷的保護作用及可能機制.pdf

1、目的:
　　通過體外研究，觀察PON1基因過表達對敵敵畏致小鼠膈肌細胞損傷的保護作用，并研究其保護機制。
　　方法:
　　實驗一:構(gòu)建攜帶PON1基因的慢病毒載體，通過觀察綠色熒光以確定慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，并用RT-PCR、Western blot法檢測PON1mRNA和蛋白的表達情況，進一步驗證過表達載體的構(gòu)建。常規(guī)培養(yǎng)小鼠膈肌細胞，轉(zhuǎn)染過表達慢病毒載體，將細胞分為正常對照組，敵敵畏(DDVP)組，LV-GFP+D

2、DVP組，LV-PON1+DDVP組，CCK-8法檢測細胞存活率、流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況，RT-PCR及Western blot法檢測小鼠膈肌細胞PON1的表達情況。實驗二:常規(guī)培養(yǎng)小鼠膈肌細胞，轉(zhuǎn)染過表達慢病毒載體，將細胞分為正常對照組，敵敵畏(DDVP)組，LV-GFP+DDVP組，LV-PON1+DDVP組，ELISA法檢測細胞乙酰膽堿酯酶(AchE)水平、血紅素氧合酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)，RT-PC

3、R、Western blot法檢測小鼠膈肌細胞核因子NF-E2相關因子水平(Nrf2)的表達情況，化學比色法檢測細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)水平。
　　結(jié)果:
　　實驗一:
　　(1)過表達慢病毒載體的驗證:熒光顯微鏡下觀察小鼠膈肌細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，慢病毒載體的轉(zhuǎn)染率達到80％以上。RT-PCR、Western blot法結(jié)果顯示小鼠膈肌細胞在轉(zhuǎn)染LV-PON1

4、后PON1mRNA和蛋白表達明顯升高，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)80μ mol/L DDVP誘導24h可明顯抑制小鼠膈肌細胞的生長，生存率為82.1％，并呈現(xiàn)劑量依賴性。160umol/LDDVP誘導小鼠膈肌細胞6、12、24h后，細胞的存活率分別為76.1％、66.5％、53.6％，呈時間依賴性。
　　(3)PON1基因過表達對DDVP誘導后小鼠膈肌細胞PON1mRNA及蛋白表達的影響

5、:與正常對照組相比，160umol/L DDVP誘導24h后， DDVP組和LV-GFP+DDVP組PON1 mRNA及蛋白的表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組PON1 mRNA和蛋白的表達水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(4)PON1基因過表達對DDVP誘導后小鼠膈肌細胞生存率的影響:160μ mol/L DDVP誘導小鼠膈肌細胞，各組細胞生長受抑

6、制的程度具有時間依賴性。誘導24h，各組細胞的生長明顯受抑，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。PON1基因過表達能明顯抵抗DDVP對小鼠膈肌細胞生長的抑制作用，與相應時間點DDVP組和LV-GFP+DDVP組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(5)PON1基因過表達對小鼠膈肌細胞凋亡率的影響:PON1基因過表達能抑制DDVP誘導所致小鼠膈肌細胞的凋亡，與DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組細胞的

7、凋亡率減少。
　　實驗二:
　　(1)PON1基因過表達對DDVP誘導小鼠膈肌細胞后AchE水平的影響:160umol/L DDVP誘導后，各組細胞AchE水平在各個時間點均下降，且呈時間依賴性。與正常對照組相比，DDVP組和LV-GFP+DDVP組細胞AchE水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);LV-PON1+DDVP組AchE水平明顯高于DDVP組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)PON1基因

8、對DDVP誘導后小鼠膈肌細胞氧化應激指標的影響:與正常對照組相比，各時間點DDVP組和LV-GFP+DDVP組SOD、CAT活力降低，MDA含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);LV-PON1+DDVP組SOD、CAT活力明顯高于DDVP組，MDA含量明顯低于DDVP組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3)PON1基因過表達對DDVP誘導小鼠膈肌細胞后Nrf2mRNA和蛋白表達的影響:DDVP誘導24小時后，LV

9、-PON1+DDVP組Nrf2 mRNA和蛋白的表達升高，與DDVP組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(4)PON1基因過表達對DDVP誘導小鼠膈肌細胞后HO-1和NQO-1水平的影響:與相應時間點DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組HO-1、NQO-1的水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PON1基因過表達能有效保護小鼠膈肌細胞，降低DDVP對細胞生長的抑制作用，減少