Epha4在胃癌組織中表達及意義.pdf

1、目的：和背景:
　　 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)報道全世界在2002年新診斷惡性腫瘤病例為10900000,因癌癥死亡病例數(shù)為6700000?，F(xiàn)患癌癥患者24600000.其中胃癌新發(fā)病數(shù)為934000,其排位由原來的第二位降到了第四位(乳腺癌躍居第二位),而死亡病例數(shù)為700000,仍僅次于肺癌占第二位。胃癌的流行病學有明顯的地理差別,日本、中國智利遠東歐洲和俄羅斯為高發(fā)地區(qū),而美國澳大利亞丹麥新西蘭發(fā)病最低,2/3

2、的胃癌患者在發(fā)展中國家,其中中國占42％胃癌是我國的最常見惡性腫瘤之一據(jù)1990-1992年我國1/10人口惡性腫瘤死因抽樣發(fā)現(xiàn),胃癌死亡率占第一位(粗死亡率為25.2/10萬)。西北地區(qū)和東南沿海地區(qū)發(fā)病率較高,廣西廣東貴州發(fā)病率低,近30年來,我國城市居民胃癌發(fā)病率在男女性中都呈下降趨勢,但衛(wèi)生部信息統(tǒng)計中心2001年的資料顯示,全國城市居民惡性腫瘤死因順序中胃癌仍占第三位。胃癌仍是嚴重威脅人民健康的疾病1。盡管在一些研究中心發(fā)現(xiàn),

3、近年來胃癌預后有所改善,但以人群為基礎的胃癌總體生存率仍未見明顯提高。研究明,腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導致胃癌病人預后不良的主要因為,如何預防和治療胃癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移是當今胃癌研究的重點之一。Epha4屬于酪氨酸蛋白激酶受體(ireceptortyrosinekinases,RTKs)家族中的較大分支Eph亞族。廣泛參與細胞生長、分化、遷延、作為Eph家族一員,Epha4廣泛表達于正常的各組織器官中,并在人體多種腫瘤組織中高表達。近期研究發(fā)現(xiàn),E

4、pha4可促進一些腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。因Epha4在人體胃癌中表達的少有研究,其在胃癌中的表達與腫瘤臨床病理特征之間的關系報道較少報道。探索Epha4在胃癌中的表達,有助于進一步了解胃癌惡性發(fā)展機制,為胃癌分子的靶向治療提供依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1.組織標本以及患者病理資料的搜集,病理載玻片的制備
　　 隨機選取鄭州大學一附院2008年5月～12月共66例胃癌根治手術切除標本,相應癌旁組織標本40例,癌旁

5、組織距瘤緣3～5ern經(jīng)過病理證實均無癌成份,另外收集距瘤緣5～10em經(jīng)病相應病理學證實確認為正常組織標本14例,所有標本組織手術切下后一部分放入凍存管中,并迅速移至-80℃冰箱凍存,另一部分立即放10％中性福爾馬林溶液內(nèi)固定,石蠟包埋,切片機切割病理組織以4μm平均厚度制備組織切片,所有患者均經(jīng)術后組織病理學確診為胃癌,術前均未接受化療和放療,其中男性34例(63.0％),女性32例(37.0％),年齡26～80歲,平均58歲,患者

6、年齡,性別,腫塊大小,病理分期統(tǒng)計完成,腫瘤的臨床病理分期依據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)所定的胃癌分期法。
　　 2.標本中epha4mRNA表達水平的測定。
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RX-PCR)方法,在液氮速凍條件下把2對組織標本磨成粉末,以Trizol試劑提取組織總RNA,行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR。所用引物根據(jù)采用PRIMER3軟件設計EphA4144bp上游F:5’-GGGCGTCTCAAAGTGC-3’

7、下游R:5’-GTGAATGATGTTCGGATG-3’內(nèi)參GAPDH:379bp上游F:5’-CCCATCACCATCTTCCAGG-3’下游R:5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’PCR程序:95℃預變性4min；94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s；共29個循環(huán)；72℃充分延伸8min.2％瓊脂糖凝膠電泳擴增產(chǎn)物置于2％的瓊脂糖凝膠(0.5pg/ml澳化乙錠染色)上,80v電約30mni,紫外反射投射儀

8、下觀察條帶,凝膠圖像分析儀對目的基因(Epha4)及內(nèi)參照基因(GADPH)進行積分吸光度分析并攝像,對比DNAmakrer,擴增出144bp條帶為陽性表達,內(nèi)參照基因為379bp條帶。Epha4/GADPH灰度比值代表目的基因Epha4mRNA在各樣本中的表達水平。
　　 3.標本中epha4蛋白水平的測定
　　 免疫組化染色采用免疫組化SP法,石蠟標本行4μm厚連續(xù)切片,具體染色方法按試劑盒說明書進行。Epha4染色

9、結果判定以腫瘤細胞陽性百分比及染色強度進行腫瘤細胞陽性計分,陽性結果判定:首先在高倍鏡下計數(shù)1000個腫瘤細胞,避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)域,根據(jù)陽性瘤細胞數(shù)目所占百分比得出Epha4標記指數(shù)(L1)。L1=陽性瘤細胞/1000個瘤細胞×100％。分為以下4級記分:陰性0分,<10％；Ⅰ級1分,10％～25％；Ⅱ級2分,25％～50％；Ⅲ級3分,50％以上。按瘤細胞著色的深淺計分染色強度:1分,弱；2分,中等；3分,強。2個分值相加即為該標本

10、的免疫組化陽性計分:0～1分為陰性,記為(-)；1～4分為弱陽性,記為(+)；5分以上為陽性,記為(++)。其中,(-)和(+)為低表達組,(++)為高表達組。
　　 4.統(tǒng)計學分析
　　 所有數(shù)據(jù)均由SPSS1110 for windows統(tǒng)計軟件分析處理。Epha4蛋白表達與臨床各病理因素之間的顯著性以及兩者表達的相關性采用x檢驗；檢驗水準a=0.05,mRNA在不同組織中的表達采用方差分析及兩兩比較的方法。

11、　　 結果：
　　 1.Epha4mRNA的表達特征為分析Epha4mRNA在胃癌和癌旁組織中表達情況,對配對胃癌組織標本進行RT-PCR熒光檢測比較。結果顯示,腫瘤組織中Epha4基因mRNA表達明顯高于癌旁正常組織和正常組織其差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。癌旁組織及正常胃組織之間無明顯差異(p>0.05)
　　 2.免疫組化分析Epha4蛋白在胃癌組織中的表達免疫組化染色顯示:66例胃癌患者的石蠟切片標本中,

12、Epha4蛋白陽性率為53.0％(35/66),陽性表達主要集中在癌細胞胞漿中,表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒,也有少量為胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色,而對照組癌旁組織中Epha4陽性率27.5％(11/40)正常組織中Epha4陽性率14.3％(2/141。
　　 3.Epha4胃癌的各臨床病理因素與表達的關系如表2所示,Epha4的表達與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關,其陽性表達率分別為36.67％、66.6

13、7％(p<0.05)28.57％、71.05％(p<0.01)27.78％、62.50％(p<0.05)；38.64％、81.81％(p<0.01)即隨著腫瘤分化程度降低Epha4陽性表達率也增高；隨著癌組織臨床分期的增加,Epha4在癌細胞內(nèi)的含量逐漸增高；有淋巴結轉(zhuǎn)移者Epha4陽性表達率明顯高于無淋巴結轉(zhuǎn)移者；遠處轉(zhuǎn)移者Epha4的陽性表達率明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移者。而Epha4與患者性別、年齡、腫瘤的大小、浸潤深度(p>0.05)無

14、關。
　　 結論：
　　 1.EphA4在胃癌組織中呈高表達,其高表達與胃癌的分化程度、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關,而與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤的大小、癌組織浸潤深度(p>0.05)無關。
　　 2.腫瘤組織中Epha4基因mRNA表達明顯高于癌旁正常組織和正常組織其差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。Epha4 mRNA在癌旁組織及正常胃組織之間無明顯差異(p>0.05)。
　　 3.Ep