姜黃素對腹膜透析相關性腹膜炎大鼠腹膜TLR2，TLR6及TNF-α表達的影響.pdf

1、目的： 腹膜透析相關性腹膜炎是腹膜透析過程中最常見的并發(fā)癥。在腹膜透析相關性腹膜炎中，以革蘭氏陽性菌感染為主。病理改變主要表現(xiàn)為腹膜層單核巨噬細胞浸潤和腹膜間皮細胞外基質(zhì)的沉積，最終導致腹膜透析失敗。因此，如何對其進行防治一直是臨床研究的熱點。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類可以識別保守的病原相關分子模式(pathogenassociated molecular pattems，PAMPs

2、)的跨膜受體，是機體天然免疫的重要組成部分。通過對PAMPs的識別，TLRs在機體抵御病毒及病菌感染的過程中發(fā)揮重要的作用。迄今為止，在人類中鑒定出10種TOLL樣蛋白(TLR1-10)。在這些TLRs中，TLR2和TLR6被發(fā)現(xiàn)與革蘭氏陽性菌成分肽聚糖(peptidoglycan，PGN)和質(zhì)膜酸(lipoteichoic acid，LTA)的識別有關。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是80年代發(fā)現(xiàn)的

3、巨噬細胞和單核細胞分泌的一種重要的細胞因子。具有多種生物效應，主要是介導抗腫瘤及調(diào)節(jié)機體的免疫功能，并且參與炎癥病變的多方面病理生理變化。姜黃素是一種從姜科植物Curcumalonga的根莖姜黃中提取的一種植物多酚，有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凝、抗腫瘤、抗突變等多方面的藥理作用研究表明，姜黃素作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以調(diào)控T細胞、B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞等免疫細胞的活性與數(shù)量。姜黃素也可在一些炎癥中下調(diào)一些炎性反應因子，如腫

4、瘤壞死因子、白細胞介素(interleukin，IL)-1，-2，-6，-8，-12等。因此，本實驗旨在研究姜黃素對表皮葡萄球菌所致的急性腹膜炎過程中TLR2、TLR6和TNF-α的表達的影響。 材料與方法 一、實驗分組 SD大鼠，雌雄并用，共72只，體重250-300g，隨機分為2組，姜黃處理組和無姜黃處理組。每組內(nèi)動物再分為6小組，除第1組給予等量生理鹽水外，其余各組動物給予表皮葡萄球菌腹腔注射(107/ml

5、colony-formingunits，dilutedin3.86％dialysate)制作急性腹膜炎模型。姜黃處理組在腹腔注射皮葡萄球菌前18小時給予姜黃素腹腔注射(1mg/kg)。實驗動物存活3，6，12，24和48h后過量麻藥處死，取腹水及眼血做常規(guī)腹水及血常規(guī)檢測；取出腹膜處理備用。 二、檢測方法 1、腹膜的組織學改變將切片置于蘇木精染色液中15-20min，自來水沖洗；后切片置于0.5％HCL酒精中數(shù)秒，自來水

6、洗3次后稍浸泡；切片置于伊紅染色液中2-3min。切片脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察結果。 2、免疫組織化學檢測實驗動物麻醉后，常規(guī)灌流、固定、取材、切片，3％H2O210min，BSA封閉1h，TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育過夜(4℃)，二抗常溫孵育2h，SABC常溫孵育1h，DAB顯色，3、TLR2、TLR6和TNF-α的蛋白質(zhì)表達過量麻藥處死動物，迅速取大腦并剝離海馬，樣品剪碎后加入裂解液4℃過夜?？捡R斯亮藍法進行

7、蛋白定量，各組取等量蛋白，聚丙酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上；脫脂奶粉溶液封閉3-7h；TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育過夜(4℃)；二抗常溫下孵育2h；后進行顯色、曝光、膠片掃描、定量分析。 4、TLR2、TLR6和TNF-α的mRNA表達采用Trizol一步法提取大鼠腹膜總RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄。采用引物為：TLR2(5'-GGAGGTGTTGGATGTTAG-3'；5'-GCTTGAAGGGTGGGTC-3')

8、；TLR6(5'-ACTCACCAGAGGTCCAA-3'；5'-GGATGAATGGCGTGTC-3')；TNF-a(5'-GCCACCACGCTCTTCTG-3'，5'-GCAGCCTTGTCCCTTGA-3').PCR擴增后，PCR擴增產(chǎn)物用3％瓊脂糖凝膠進行電泳分離觀察，成像，Image-proPlus6.0軟件包分析。 結果： 一、腹水白細胞檢測結果腹腔注射表皮葡萄球菌后3小時，腹水白細胞開始升高。姜黃處理組與

9、非姜黃處理組相比，姜黃素處理組腹水白細胞在腹腔注射表皮葡萄球菌后3h、6h、12h、24h數(shù)量減少且有統(tǒng)計學意義。 二、HE染色結果實驗動物腹腔注射表皮葡萄球菌后，腹膜出現(xiàn)水腫和細胞形態(tài)改變。選取腹腔注射表皮葡萄球菌后24h的腹膜切片對比，非姜黃素處理組腹膜間皮細胞損傷嚴重，細胞變形、碎裂；姜黃素處理組也存在一定程度的間皮細胞變形碎裂，但程度較非姜黃素處理組為輕。 三、TLR2、TLR6和TNF-α免疫組織化學結果TLR

10、2和TLR6免疫陽性反應主要位于腹膜間皮細胞。對于未注射表皮葡萄球菌的對照動物，姜黃素處理組與非姜黃素處理組TLR2和TLR6免疫陽性無明顯差別。姜黃素處理組與非姜黃素處理組的實驗動物在注射表皮葡萄球菌后3h，6h，12h，24h，TLR2和TLR6免疫組織化學染色逐漸增強其在感染后48h則有所減弱。而與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6免疫組織化學染色在注射表皮葡萄球菌后3h，6h，12h，24h明顯減弱，而在感染后4

11、8h則無明顯區(qū)別。此外，姜黃素處理組的細胞形態(tài)明顯好于非姜黃組處理組。TNF-α免疫染色自感染后3h開始逐漸加深，24小時達到高峰。與無姜黃素處理組相比，姜黃素處理組實驗動物腹膜的免疫反應有著明顯的減輕。 四、TLR2、TLR6和TNF-α蛋白表達的Western-blot分析我們采用Western-blot技術對TLR2和TLR6的表達水平進行分析。在各個時間點，TLR2和TLR6的表達變化趨勢令人吃驚的非常相似，統(tǒng)計結果表明

12、TLR2和TLR6表達水平在感染后6h至24h呈時間依賴性上升。統(tǒng)計結果同時表明，與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6表達含量在感染后6h/12h/24h明顯下降且具有統(tǒng)計學意義。在各個時間點TNF-α表達水平在感染后3h至24h呈時間依賴性上升。同時與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TNF-α表達含量在感染后6h/12h/24h明顯下降且具有統(tǒng)計學意義。 五、TLR2、TLR6和TNF-αmRNA表達的RT-P

13、CR分析我們采用RT-PCR技術對TLR2和TLR6mRNA水平表達進行了分析。在各個時間點，TLR2和TLR6mRNA表達趨勢是一致的，且其在感染后6h至24h呈時間依賴性上升。與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6mRNA表達明顯減少并具有統(tǒng)計學意義。TNF-α的mRNA表達在感染后6h至24h呈時間依賴性上升。與非姜黃素處理組相比，姜黃素處理組TNF-αmRNA表達明顯減少并具有統(tǒng)計學意義。 結論：