小窩蛋白-1在腹膜透析及其相關(guān)性腹膜炎中的作用.pdf

1、腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)作為一種有效的腎臟替代療法被全世界廣泛應(yīng)用于治療終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)，它不但具有與血液透析(hemodialysis，HD)近似等同的長期療效，還具有HD所不可替代的優(yōu)越性。因此，更好地理解PD的作用機(jī)理、防治PD相關(guān)性并發(fā)癥成為當(dāng)前推廣PD重要的前提工作。 在PD的治療過程中，腹膜炎是導(dǎo)致PD技術(shù)失敗、患者發(fā)生并發(fā)癥及

2、患者死亡的重要原因。所以，理解腹膜炎的病理生理和分子生物學(xué)機(jī)制是找到減輕炎癥所致腹膜功能和結(jié)構(gòu)損傷的可行途徑的必要條件，并為發(fā)現(xiàn)新的防治手段鋪路。以往的研究證實(shí)，跨腹膜水及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)主要取決于腹膜內(nèi)在通透性和腹膜有效表面積(effective peritoneal surface area，EPSA)。來自臨床患者和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型的各方面數(shù)據(jù)顯示，在急性腹膜炎發(fā)生時(shí)，EPSA和腹膜內(nèi)在通透性的增加導(dǎo)致加速的葡萄糖滲透梯度的消散，最終引發(fā)超

3、濾衰竭(ultrafiltration failure，UFF)。在此種情形，鏡下通常可見腹膜組織炎性細(xì)胞浸潤和血管增生。 小窩被定義為質(zhì)膜上80～100nm的盤形凹陷。在過去的幾十年里，小窩一直被譽(yù)為參與多種細(xì)胞功能的“門戶細(xì)胞器”。小窩尤其富含于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與多項(xiàng)血管功能。關(guān)于小窩對(duì)血管通透性的調(diào)節(jié)，常被描述為兩條經(jīng)典途徑—①通過胞吞作用完成的直接的跨細(xì)胞途徑；②借助對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial ni

4、tric oxide synthase，eNOS)的強(qiáng)大抑制而間接實(shí)現(xiàn)的旁細(xì)胞途徑?？紤]到小窩在腹膜所處的重要位置—微血管內(nèi)皮單層，一個(gè)水和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要屏障，我們推測，小窩在特定條件下(如腹膜炎)可能對(duì)腹膜功能和結(jié)構(gòu)的維持或者改變起關(guān)鍵作用；同時(shí)在這個(gè)屏障中起重要作用的還有既已研究過的其他兩個(gè)通透性調(diào)節(jié)蛋白eNOS和水通道蛋白(AQP-1)。 小窩蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是驅(qū)動(dòng)小窩形成的重要蛋白。小窩蛋白1

5、基因(Cav1)缺陷的細(xì)胞不能表達(dá)Cav-1，從而無法形成小窩，鏡下表現(xiàn)為質(zhì)膜表面盤形凹陷的小窩丟失。近年證明，基因修飾鼠對(duì)研究PD機(jī)制的分子對(duì)應(yīng)物有利和有效，因而Cavl缺陷鼠(Cavl-deficient mice，Cavl-/-mice)無疑將為體內(nèi)研究小窩的假定功能提供有力工具。 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌外膜的組成部分，曾被經(jīng)典地用作誘導(dǎo)大鼠急性腹膜炎。本研究我們通過

6、建立LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腹膜炎模型來觀察Cavl-/-鼠在炎癥影響下腹膜的功能和結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而探討Cav-1在PD的炎癥狀態(tài)下所發(fā)揮的作用。 方法： (一)動(dòng)物分組及腹膜炎模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用以C57BL/6J為背景的雄性Carl-/-鼠及與其配對(duì)的野生型(Cavl+/+)鼠。兩組周齡(9-12周)配對(duì)的雄性Cavl+/+鼠和Cavl-/-鼠分別用來研究基礎(chǔ)狀態(tài)下的PD(對(duì)照組)和炎癥狀態(tài)下的PD(腹膜炎組)。每組

7、包含6對(duì)小鼠。急性腹膜炎以腹腔注射LPS(10mg/kg)完成。LPS給藥18小時(shí)后，小鼠用來進(jìn)行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)(peritoneal equilibration test，PET)。PET選用2.5ml、7％的葡萄糖透析液，通過2小時(shí)的腹膜交換來獲得通透性參數(shù)。 (二)腹膜通透性測定和標(biāo)本采集 將對(duì)照組小鼠或LPS給藥18小時(shí)后的腹膜炎組小鼠酌情給予氯胺酮、甲苯噻嗪聯(lián)合皮下麻醉。行頸總動(dòng)脈插管術(shù)。術(shù)后30分鐘，將2.5m

8、l、7％的葡萄糖透析液經(jīng)由導(dǎo)管灌入腹腔。分別在第0、30、60和120分鐘從頸動(dòng)脈導(dǎo)管端或透析導(dǎo)管端收集血液或透析液標(biāo)本。紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)在PD交換前測定。PET結(jié)束后，收集腹腔內(nèi)全部透析液，計(jì)算凈超濾(ultrafiltration，UF)。計(jì)數(shù)透析液中的白細(xì)胞。樣本中的尿素氮、葡萄糖及鈉濃度由生化分析儀測定。透析液中的總蛋白含量由Bio-Rad法測定。處死小鼠后，小部分臟層和壁層腹膜標(biāo)本由多聚甲醛固定，其余

9、的臟層腹膜以液氮快速冷凍并貯存。 (三)免疫印跡 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)法。免疫印跡至少重復(fù)3次，將掃描后的圖像進(jìn)行光密度分析。 (四)組織染色和免疫組織化學(xué) Hemalun-eosine(HE)染色和免疫組織化學(xué)法。免疫組織化學(xué)在必要情形下進(jìn)行抗原修復(fù)。組織

10、片在攝像顯微鏡下觀察并拍攝。細(xì)胞計(jì)數(shù)通過計(jì)數(shù)器在鏡下完成。 (五)硝酸鹽/亞硝酸鹽(Nitrite/Nitrate，NOx)的測定 透析液中的NOx測定依照說明書指令進(jìn)行操作，使用基于Criess反應(yīng)的比色法。 (六)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用ANOVA方差分析。P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： (一)Cav1的缺失對(duì)基礎(chǔ)PD的效應(yīng)

11、 Cav1-/-鼠的紅細(xì)胞壓積較Cav1+/+鼠顯著升高。盡管與Cav1+/+鼠相比，Cav1-/-鼠透析液中NOx有40％的增高，但這種增高未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小分子如尿素、葡萄糖及鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)和超濾能力在Cav1+/+鼠與Cav1-/-鼠兩組極為相似，然而反映在透析液總蛋白含量上的大分子轉(zhuǎn)運(yùn)在Cav1-/-鼠明顯增加。組織染色顯示Cav1-/-鼠的臟層腹膜沒有明顯的血管異常和增生。免疫印跡證實(shí)了AQP-1、eNOS、iNOS的表達(dá)在C

12、av1-/-鼠和Cav1+/+鼠中沒有差別。 (二)LPS誘導(dǎo)的腹膜炎對(duì)Cav1缺陷鼠的功能作用 內(nèi)毒素血癥的Cav1-/-鼠血漿尿素氮水平有顯著升高。LPS給藥18小時(shí)后，受感染的Car1缺陷鼠(P-Cav1-/-鼠)不像野生型那樣表現(xiàn)為與基礎(chǔ)狀態(tài)相比成倍增高的透析液白細(xì)胞計(jì)數(shù)。炎癥組比對(duì)照組透析液中有10倍左右的NOx增高。急性腹膜炎所致的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)改變在P-Cav1-/-鼠有明顯減輕，尤其表現(xiàn)在高滲透析液留腹初期(前

13、30分鐘)。與P-Cav1+/+鼠相比，P-Cav1-/-鼠顯示相對(duì)低的尿素通透性，相對(duì)慢的透析液葡萄糖重吸收，部分恢復(fù)的鈉篩和最終減輕的UFF。免疫印跡證實(shí)，AQP-1表達(dá)在P-Cav1-/-鼠中顯著高于P-Cav1+/+鼠。P-Cav1-/-鼠腹膜被炎癥細(xì)胞浸潤的程度減低。免疫組織化學(xué)顯示在P-Cav1-/-鼠腹膜毛細(xì)血管內(nèi)巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子F4/80的表達(dá)與P-Cav1+/+鼠相似，而粘附因子ICAM-1的表達(dá)較P-Cav1+/+鼠