Lipocalin-2基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)人胚腎細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建載有Lipocalin-2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1和原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)，觀察其表達(dá)蛋白對(duì)人胚腎細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法 利用 RT-PCR 從鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7中擴(kuò)增目的基因Lcn-2，分別克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-Cl 和原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中。用質(zhì)粒pET32a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli.，制備重組Lcn-2。將真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-C1 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法穩(wěn)

2、定轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞，通過熒光觀察，RT-PCR鑒定該基因的表達(dá)。從外源加入重組Lcn-2蛋白和真核轉(zhuǎn)染胞內(nèi)表達(dá) Lcn-2 兩種途徑作用于人胚腎細(xì)胞，通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)MTT法和免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原 PCNA 的表達(dá)，來反映Lcn-2基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)人胚腎細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果： 經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，Lcn-2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；在重組Lcn-2最佳作用終濃度為0.5×10-6 mol/L條件下，細(xì)胞培養(yǎng)72h時(shí)做M

3、TT。法細(xì)胞增殖試驗(yàn)，重組Lcn-2 處理組 OD 值為1.891±0.165，未處理組OD值為1.522±0.0467，二者差異顯著(P＜0.0 1)，而重組質(zhì)粒 PL-2組和空質(zhì)粒pEGFP-C1組的OD值差異不顯著(P＞0.05)；同樣的條件，將細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)72h做免疫印跡實(shí)驗(yàn)，重組Lcn-2處理組凈 OD 值為0.684±0.009，未處理組凈 OD 值為0.563±0.001，二者差異顯著(P＜0.05)，而重組質(zhì)粒PL-2組