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文檔簡介
1、骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為較低的骨密度,是一種容易導(dǎo)致骨折的全身性骨骼疾病,嚴(yán)重影響公眾健康,與骨骼發(fā)育有密切關(guān)系。本研究室早期通過基因差異表達(dá)譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等,發(fā)現(xiàn)STAT1基因與骨質(zhì)疏松密切相關(guān),但不清楚STAT1基因在體調(diào)控骨骼發(fā)育而導(dǎo)致骨表型改變的作用機(jī)制,所以本研究結(jié)合分子遺傳學(xué)手段,選擇斑馬魚模型進(jìn)行在體研究,進(jìn)一步揭示骨骼發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制,對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防、診斷、治療以及藥物開發(fā)都有重要意義。斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過程中的
2、基因、信號通路有高度同源性,且STAT1基因進(jìn)化上較為保守,人類STAT1基因的兩個不同剪接體STAT1-alpha和STAT1-beta對應(yīng)于斑馬魚兩個不同基因stat1a和stat1b,研究發(fā)現(xiàn)stat1a在斑馬魚胚胎早期表達(dá)量特別高。而且,與其他動物模型相比,斑馬魚個體小、幼魚通體透明,利于骨骼發(fā)育的觀察。
本文主要通過CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù),在斑馬魚stat1a基因上設(shè)計合適的打靶位點(diǎn),將體外合成的特異性s
3、gRNA(終濃度20ng/μL)和Cas9-mRNA(終濃度300 ng/μL)顯微共注射進(jìn)斑馬魚一細(xì)胞內(nèi),并通過活性檢測證實(shí)了所選位點(diǎn)的有效性。對F0代斑馬魚提取基因組DNA后進(jìn)行T7E1酶切檢測以及Sanger測序,成功篩選到2條stat1a基因突變的F0代斑馬魚。在F1代受精后20天、30天和47天,隨機(jī)挑取兩個突變體的F1代斑馬魚和野生型斑馬魚各10條,測量其長度,發(fā)現(xiàn)突變體F1代斑馬魚要比野生型生長速度更快。結(jié)果與小鼠stat
4、1-/-敲除研究發(fā)現(xiàn)骨密度與骨量增加一致,提示stat1可能通過抑制成骨細(xì)胞生成影響骨骼發(fā)育。目前,已經(jīng)從F2代胚胎中鑒定到stat1a突變體純合子。用Phyre軟件預(yù)測F1代突變體STAT1蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),其二級結(jié)構(gòu)的某些保守結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)發(fā)生改變。STAT1蛋白的V638和S639處是同源二聚體界面,對應(yīng)于F1代突變體的這兩個氨基酸位點(diǎn),V630和S631卻不再是同源二聚體接觸面??赡苁怯捎趕tat1a基因突變影響STAT1同源二
5、聚體的結(jié)合,影響骨骼的生長發(fā)育,從而導(dǎo)致斑馬魚生長更快。
為進(jìn)一步分析stat1a基因敲除后的變化,利用不同濃度STAT1抑制劑磷酸氟達(dá)拉濱(Fludarabine)處理斑馬魚胚胎10天,發(fā)現(xiàn)隨濃度增加死亡率也隨之增加。低于5μg/mL濃度組的死亡率低于10%,10μg/mL、20μg/mL以及40μg/mL濃度組死亡率達(dá)到30%-40%,而50μg/mL濃度組從處理第5天開始,死亡率接近70%。從處理第3天開始,實(shí)驗(yàn)組斑馬魚
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