竹筍殼多元發(fā)酵轉(zhuǎn)化微藻生物質(zhì).pdf

1、竹筍殼是農(nóng)產(chǎn)品加工行業(yè)的副產(chǎn)品，產(chǎn)量大、價(jià)值低，處理不好會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。竹筍殼中纖維素和半纖維素含量達(dá)70％以上，將竹筍殼通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的方式煉制成其它類型的生物制品，具有理論可行性。衣藻屬于單細(xì)胞植物，衣藻細(xì)胞代謝產(chǎn)生的多糖、甘油三脂、蛋白質(zhì)、色素等產(chǎn)物可以應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、基因工程、生物質(zhì)燃料等領(lǐng)域，目前制約微藻產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要因素就是衣藻的培養(yǎng)成本。乙酸是培養(yǎng)衣藻的最優(yōu)碳源，利用純乙酸規(guī)?；囵B(yǎng)衣藻，成本高昂，限制了衣藻在

2、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用。本論文基于竹筍殼的資源化利用和開發(fā)衣藻廉價(jià)新碳源的目的，分離篩選高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株，分解竹筍殼的纖維素;利用平菇分解竹筍殼中的木質(zhì)素，提高纖維素的降解效率;將黑曲霉和平菇共培養(yǎng)分解竹筍殼，獲得竹筍殼水解液，經(jīng)再次糖化、大腸桿菌厭氧發(fā)酵，獲得酸化的糖化液，用于衣藻細(xì)胞的培養(yǎng);利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，明確衣藻在單乙酸碳源培養(yǎng)基和竹筍殼水解液中生長(zhǎng)時(shí)差別表達(dá)的基因及其可能的機(jī)制。本論文的研究，將竹筍殼資源化利用耦合微藻生

3、物質(zhì)生產(chǎn)，具有重要的環(huán)境效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1.竹筍殼降解菌的篩選及其產(chǎn)纖維素酶性質(zhì)研究。通過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得1株竹筍殼分解菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和18S rRNA序列分析鑒定，該菌株屬于黑曲霉，被命名為Aspergillus niger N3。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化A.niger N3發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件，得出A.niger N3以竹筍殼粉為碳源液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基配方為:竹筍殼粉10.

4、0g，酵母粉2.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸餾水1000mL;最適發(fā)酵條件為起始pH6.42、培養(yǎng)溫度33.8℃、培養(yǎng)時(shí)間96h。以該優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，A.niger N3所產(chǎn)CMCase酶活為5.92U/mL，比優(yōu)化前提高了7.4％。
　　2.平菇預(yù)處理竹筍殼的增效機(jī)理。從市售平菇中分離純化到一株漆酶活力較高的平菇菌株，分別考察了碳源、氮源和誘導(dǎo)劑對(duì)該菌株產(chǎn)漆酶的影響，結(jié)果表明，竹筍殼中添加適

5、量有機(jī)氮源有利于平菇菌絲的生長(zhǎng)，麩皮可作為輔助碳源和漆酶誘導(dǎo)劑應(yīng)用于平菇預(yù)處理竹筍殼。平菇預(yù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平菇菌絲的生長(zhǎng)可以有效地破壞天然竹筍殼纖維致密的抗性結(jié)構(gòu);經(jīng)平菇預(yù)處理后的竹筍殼誘導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的效果顯著增強(qiáng)，綜合分析結(jié)果表明，這種增強(qiáng)效應(yīng)源自一種水溶性的木質(zhì)素衍生物，該發(fā)現(xiàn)為首次報(bào)道。
　　3.竹筍殼生物降解培養(yǎng)萊茵衣藻條件優(yōu)化。構(gòu)建了平菇和黑曲霉共培養(yǎng)降解竹筍殼的培養(yǎng)模式;通過(guò)響應(yīng)面的PB實(shí)驗(yàn)和Box-Behn

6、ken設(shè)計(jì)優(yōu)化了麩皮、酵母粉和KH2PO4在竹筍殼分解過(guò)程中的用量分別為2.26％、0.47％和0.46％，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明竹筍殼的最大降解率為34.14％。
　　運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了竹筍殼水解液糖化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，構(gòu)建的響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)最佳糖化條件為反應(yīng)溫度61.99℃、體系pH5.35、補(bǔ)充竹筍殼7.55g/L，獲得的糖化液中還原糖濃度最高為3.517mg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明糖化液的還原糖濃度為3.77mg/mL。
　　為了適應(yīng)

7、萊茵衣藻生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，竹筍殼糖化液濃縮2倍后經(jīng)大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙酸含量為0.74mg/mL，還原糖含量為3.41mg/mL的竹筍殼水解酸化液，以該水解液培養(yǎng)萊茵衣藻，在混合營(yíng)養(yǎng)模式下衣藻細(xì)胞的最大生長(zhǎng)率為2.71±0.06d-1，積累的生物量最高值為201.9±9.3mg L-1，衣藻細(xì)胞中總糖和總脂的含量可達(dá)44.3％和18.7％。
　　4.萊茵衣藻21gr(cc1690)菌株

8、在竹筍殼水解酸化液中生長(zhǎng)代謝的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了126個(gè)新基因，其中10個(gè)基因注釋到COG，28個(gè)注釋到GO，7個(gè)注釋到KEGG，11個(gè)注釋到Swiss-Prot，83個(gè)注釋到NR。
　　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了606個(gè)差異表達(dá)基因，其中230個(gè)基因上調(diào)，376個(gè)基因下調(diào);COG注釋結(jié)果表明，差異基因主要與能量產(chǎn)生轉(zhuǎn)化、氨基酸和碳水化合物的運(yùn)輸代謝、DNA復(fù)制、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸和代謝有關(guān);注釋到KEGG的差異