內(nèi)源性一氧化碳在硫化氫抗內(nèi)毒素肺損傷中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、目的：內(nèi)毒素急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是臨床常見的并以肺泡-毛細血管膜通透性增加為主要特征的肺部炎癥綜合征，發(fā)病急而兇險，甚至可以引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等嚴(yán)重結(jié)局。對于此種肺損傷的認(rèn)識過程已有30余年歷史，已明確內(nèi)毒素

2、急性肺損傷不僅可由感染性疾病引起，而且諸如嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷、休克、缺血-再灌注損傷和急性胰腺炎等凡可引起腸道屏障功能受損導(dǎo)致內(nèi)毒素入血的多種情況均可誘發(fā)急性肺損傷。盡管目前對其認(rèn)識和治療措施有了很大進展，但迄今臨床上對急性肺損傷尚未找到切實有效的防治措施，ARDS和MODS的病死率(40～60％)仍居高不下。因此，深入探討其發(fā)病機制，如何防治肺損傷的發(fā)生是呼吸科及重癥醫(yī)學(xué)乃至整個醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注并亟待解決的重大課題。
　　 盡管關(guān)于

3、內(nèi)毒素急性肺損傷的發(fā)病機制迄今尚未完全闡明，但現(xiàn)在較為公認(rèn)的看法是，內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的刺激使機體的炎癥反應(yīng)細胞處于激活狀態(tài)，繼而出現(xiàn)了失控的全身炎癥反應(yīng)。此時中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在肺部大量扣押、過度激活和清除延遲是肺損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。抑制PMN在肺內(nèi)扣押是控制肺組織炎癥反應(yīng)，防治此種肺損傷發(fā)生的關(guān)鍵所在。已有研究證明，P

4、MN的聚集是由位于PMN和血管內(nèi)皮細胞表面的一系列黏附分子表達上調(diào)[如細胞間黏附分子（ICAM-1）]所介導(dǎo)的，因此抑制黏附分子的表達和活性是抗肺組織內(nèi)PMN扣押的重要手段。
　　 內(nèi)源性氣體信號分子是一類具有多種病理生理作用的生物活性物質(zhì)，它們的發(fā)現(xiàn)為內(nèi)毒素急性肺損傷發(fā)病機制的研究開辟了一個新的領(lǐng)域。迄今已證實的內(nèi)源性氣體信號分子有三種，即一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon monoxide，C

5、O)和硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)。血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)是血紅素代謝的起始限速酶，其分解血紅素的過程中產(chǎn)生CO，HO-1為其誘導(dǎo)型，也稱熱休克蛋白32。多項研究認(rèn)為HO-1是細胞的一種內(nèi)源性保護蛋白，其分解產(chǎn)物如CO具有強大抗氧化功能。研究表明，LPS導(dǎo)致急性肺損傷時肺組織中HO-1表達上調(diào)，CO產(chǎn)生增多具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)等抗肺組織損傷作用；在注射LPS前，應(yīng)用HO-1誘導(dǎo)劑預(yù)先上

6、調(diào)肺內(nèi)HO-1表達，可以逆轉(zhuǎn)LPS所致的肺內(nèi)PMN扣押及ALI，表明預(yù)先上調(diào)HO-1在肺內(nèi)表達，可以抑制PMN在肺內(nèi)聚集，從而對LPS所致的肺損傷發(fā)揮防治作用。
　　 H2S是繼NO和CO之后被確認(rèn)的第三種內(nèi)源性氣體信號分子，肺組織中H2S生成的關(guān)鍵酶為胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）。我室以往的研究發(fā)現(xiàn)，LPS引起的內(nèi)源性H2S減少是肺損傷發(fā)生機制之一。與氣體信號分子CO相似，外源性H2

7、S也可以改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其保護作用也表現(xiàn)在抗氧化性損傷，抑制PMN在肺內(nèi)的大量聚集，保護肺血管內(nèi)皮完整性，改善肺微血管通透性，減少肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)滲出等方面。進一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性氣體信號分子之間存在著相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，我們也已經(jīng)證實在內(nèi)毒素急性肺損傷時H2S與CO之間可對彼此產(chǎn)生的限速酶進行調(diào)節(jié)，但H2S對內(nèi)毒素急性肺損傷的保護作用是否與CO有關(guān)尚不清楚。
　　 有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated

8、 protein kinases，MAPKs)是一組廣泛存在于細胞漿內(nèi)具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶。研究表明，MAPKs是介導(dǎo)細胞外信號引起核反應(yīng)的共同通路或匯聚點。p38MAPK是MAPKs家族中的重要一員，除可被各種炎癥介質(zhì)激活，參與調(diào)節(jié)炎癥中各種細胞反應(yīng)的細胞內(nèi)信號外，還可參與細胞的存活、分化、發(fā)育過程。核因子(NF)-κB是一類能夠和多種基因啟動子或增強子的κ位點發(fā)生特異結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子，它可被多種刺激因

9、素激活，并誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄，從而參與機體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，以及細胞的生長調(diào)控等多方面的生命活動。有文獻報道，CO可通過p38MAPK信號通路發(fā)揮抗炎作用，而H2S可下調(diào)動脈平滑肌細胞MAPK通路，由此我們推測，p38MAPK可能是CO和H2S之間發(fā)生聯(lián)系的紐帶。但對于p38MAPK及NF-κB信號通路在H2S抗PMN扣押方面的作用及與黏附分子表達的關(guān)系尚不清楚；H2S是否可通過CO抑制LPS所致肺損傷時黏附分子的

10、表達發(fā)揮抗內(nèi)毒素急性肺損傷時肺內(nèi)PMN扣押及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制均值得探討。
　　 H2S在體內(nèi)以氣體分子和HS-形式存在，后者與體內(nèi)的H+結(jié)合又生成H2S，從而在H2S和HS-間形成一種動態(tài)平衡，這樣既保證了H2S的穩(wěn)定存在又不改變內(nèi)環(huán)境的pH值。硫氫化鈉(sodiumhydrosulfide，NaHS)在水溶液中可解離成Na+和HS-，HS-與H+結(jié)合后又進一步生成H2S，因為NaHS溶液性質(zhì)穩(wěn)定且濃度易于控制，因此常代替H

11、2S氣體被用于實驗。本研究擬采用給予外源性小劑量NaHS和應(yīng)用CSE特異性的阻斷劑-快丙基甘氨酸(PPG)減少H2S產(chǎn)生的方法，觀察H2S對內(nèi)毒素急性肺損傷大鼠肺內(nèi)PMN扣押這一ALI發(fā)生的中心環(huán)節(jié)的防治作用，并從黏附分子表達變化的角度探討CO在H2S抗PMN肺內(nèi)扣押的分子機制及其與MAPKs和NF-κB的關(guān)系，為臨床防治內(nèi)毒素急性肺損傷提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 方法：將70只健康雄性SD大鼠隨機分為7組：①對照組（C

12、組）：經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（0.5ml/kg）；②LPS組：經(jīng)尾靜脈注射LPS（5mg/kg）；③LPS+NaHS組：注射LPS前10min經(jīng)腹腔注射NaHS(28μmol/kg)；④LPS+PPG（CSE抑制劑）組：注射LPS前10min經(jīng)腹腔注射PPG(45mg/kg)；⑤LPS+NaHS+ZNPP（HO-1特異性抑制劑）組：注射LPS前20min先經(jīng)腹腔注射ZNPP(10mg/kg)，其后10min注射NaHS；⑥C+PPG組：注

13、射生理鹽水前10min經(jīng)腹腔注射PPG；⑦C+NaHS組：注射生理鹽水前10min經(jīng)腹腔注射NaHS。各組均于注射后6h經(jīng)頸總動脈放血處死動物，留取肺組織。采用生化方法檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化并計數(shù)肺泡間隔中PMN數(shù)目；免疫組織化學(xué)染色觀察HO-1及ICAM-1蛋白表達變化；采用Westernblot方法檢測肺組織中磷酸化p38MAPK(p-p3

14、8MAPK)及NF-κB蛋白表達的變化。
　　 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)來表示，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異用單因素方差分析（one-wayANOVA），有顯著差異者用Student-Newmen-Kuelsq檢驗進行兩兩比較，同一組肺組織中p-p38MAPK含量與NF-κB含量之間、p-p38MAPK含量與ICAM-1含量之間以及NF-κB含量與ICAM-1含量之間采用直線相關(guān)分析，以P＜0.05為有