白樺BplMYB46基因調控抗旱耐鹽和次生壁形成的分子機理.pdf

1、MYB(avian myeloblastosis)轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族成員之一，主要參與植物次生代謝調控、激素和環(huán)境因子的應答。本研究在白樺的轉錄組中發(fā)現一個MYB基因BplMYB46，屬于R2R3 MYB類轉錄因子，通過對其進行表達研究發(fā)現BplMYB46可能與植物逆境脅迫及次生壁的形成相關。本實驗系統(tǒng)研究了BplMYB46基因在響應非生物脅迫及次生細胞壁發(fā)育過程中的功能及調控機制，為白樺逆境脅迫應答及次生代謝調控方面的

2、研究提供理論基礎。
　　1、構建35s-BplMYB46-GFP載體，利用基因槍技術瞬時轉化洋蔥表皮進行亞細胞定位，結果顯示BplMYB46基因定位在細胞核中。BplMYB46基因在NaCl、ABA和Mannitol脅迫處理6-24 h時呈上調表達，結果顯示BplMYB46基因能夠被逆境脅迫誘導表達。BplMYB46基因在莖中的表達量最高，根中其次，葉中最低，并且在莖頂端、中部和基部的表達量呈遞增趨勢。
　　2、構建BplM

3、YB46基因過表達和抑制表達載體，將其轉入白樺，獲得BplMYB46基因過表達及抑制表達的白樺轉基因植株。在NaCl、ABA和Mannitol脅迫下，以野生型白樺為對照，BplMYB46基因過表達株系的鮮重、根長以及葉綠素含量較高，相對電導率和失水率較低，并且BplMYB46基因能夠通過調控SOD和POD以及P5CS、P5CDH和ProDH等基因的表達來提高SOD和POD的活性以及脯氨酸的含量，從而降低ROS在逆境下的積累，進而顯著增強

4、轉基因白樺的抗逆能力。
　　3、將兩個月苗齡的BplMYB46基因過表達、抑制表達和野生型白樺的莖基部分別橫切，進行甲苯胺藍、鹽酸間苯三酚和熒光增白劑染色，結果顯示與野生型白樺相比，BplMYB46基因過表達白樺株系的次生壁發(fā)育程度較高，抑制表達的次生壁發(fā)育程度較低。以一年生野生型和轉基因白樺莖為材料進行次生壁組分含量的測定，結果發(fā)現BplMYB46基因過表達白樺的木質素和半纖維素含量比野生型高，纖維素含量比野生型低;抑制表達白樺

5、的木質素和半纖維素含量比野生型低，纖維素含量比野生型高。以野生型白樺為對照，與木質素、纖維素合成相關的酶PAL、CCo、4CL、POD、LAC、Cesa和3個可能與次生壁合成相關的MYB轉錄因子在BplMYB46過表達白樺中上調表達，在BplMYB46抑制表達白樺中下調表達，由此證明BplMYB46基因能夠通過調控木質素、纖維素合成相關基因的表達來促進白樺次生壁的形成。
　　4、利用酵母雙雜交技術證明BplMYB46轉錄因子具有轉

6、錄激活活性，其轉錄激活區(qū)在C端第697-915bp內;BplMYB46轉錄因子能夠與自身形成同源二聚體并與白樺的5個MYB轉錄因子形成異源二聚體。
　　5、利用酵母單雜交技術確定BplMYB46基因能識別8個順式作用元件，分別為E-box、LTRECORE、GT-1、M1、M2、M3、TCbox和AGbox，其中E-box元件主要參與光響應和苯丙氨酸生物合成途徑，LTRECORE是一個低溫調控元件，GT-1元件能夠增強植物抗病和耐

7、鹽能力，M1為響應低溫和干旱脅迫的MBSI型元件，M2是擬南芥AtMYB46識別的與次生細胞壁形成相關的元件，M3為擬南芥MYB識別的抗干旱的順式作用元件，TCbox和AGbox為兩個未知功能的元件，可能是BplMYB46基因調控的新元件。CHIP-PCR技術分析發(fā)現BplMYB46能夠與靶基因啟動子序列上的順式作用元件結合從而調控它們的表達，這些靶基因與植物逆境脅迫和次生細胞壁的形成相關。
　　6、對BplMYB46基因過表達和

8、抑制表達轉基因白樺進行數字基因表達譜測序分析，結果發(fā)現2421條差異表達的基因，其中上調表達的基因為952條，下調表達的基因為1469條;差異基因涉及新陳代謝、次生代謝、植物激素信號轉導途徑以及苯丙烷和類黃酮生物合成等途徑。在差異基因中發(fā)現一些與植物逆境脅迫相關的ERF基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因、過氧化物酶(POD)基因、熱激蛋白（HSP）基因，與木質素合成相關的肉桂醇脫氫酶(CAD)基因、肉桂酰CoA還原酶（CCR）基因和漆酶