基于表面等離子體共振原理的病原體快速檢測芯片的研制.pdf

1、目的：構(gòu)建基于表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)原理的病原體快速檢測基因芯片。利用SPR傳感器的快速、敏感、高效、不需標(biāo)記及純化等特點，建立一套完整的基因芯片系統(tǒng)檢測技術(shù)，使之具有設(shè)備簡單，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，技術(shù)穩(wěn)定易于掌握等優(yōu)點，達到使基因芯片的檢測技術(shù)能更適用于臨床、普通實驗室甚至更復(fù)雜環(huán)境的目的。 方法：1.通過查閱文獻報道以及臨床調(diào)查，確定檢測靶病原體。對各靶病原體的特征性核酸

2、標(biāo)志進行確定以及擴增引物的設(shè)計并對擴增條件進行優(yōu)化確定；2.設(shè)計各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)方法對探針進行計算機模擬篩選；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應(yīng)的50nm金膜層，并比較了常用兩種不同直徑膠體金溶液金膜鋪制方法的效果；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(shù)(Self-assembledMonolayer，SAM)固定探針，制備具有SPR響應(yīng)的基因檢測芯片，并對自組裝時間，探針濃度等進行優(yōu)化；5.將篩選出的檢測

3、探針、陽性對照探針以及陰性探針點利用SAM技術(shù)制成雜交芯片，利用酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光法對各探針的雜交性能進行檢測；6.利用SPR檢測系統(tǒng)對所構(gòu)建芯片的檢測性能進行了測試；7.結(jié)合Chelex-100處理臨床樣品進行檢測，與常規(guī)臨床檢測方法比較該芯片的檢測特性。 結(jié)果：1.確定了7種臨床常見的感染病原體及臨床少見但重要的病原體為檢測目標(biāo)，包括：淋病奈瑟氏菌，人類乳頭瘤病毒(HPV)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿

4、菌、洛菲氏不動桿菌。并完成各靶病原體特征性核酸標(biāo)志的確定以及擴增引物的設(shè)計并對擴增條件進行優(yōu)化確定；2.設(shè)計各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學(xué)方法對探針進行計算機模擬篩選，各探針的G+C含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、自身二聚體以及重復(fù)堿基數(shù)等指標(biāo)均符合寡核苷酸探針設(shè)計要求，所選用探針特異性強，雜交溫度均＜65℃；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應(yīng)的50nm金膜層：確定Frens法(檸檬酸鈉還原法)膠體金溶液配制，以及膠體金納米粒子自組裝單層

5、膜為催化模板，氯金酸/羥胺金膜鍍制法金膜鋪制方法。通過比較確定使用2.5nm膠體金法鋪制金膜；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(shù)(SAM)固定探針，制備具有SPR響應(yīng)的基因檢測芯片，并確定自組裝時間為4.5小時，探針濃度為：1500nmol/L；5.酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光法檢測顯示，相應(yīng)檢測探針點及陽性對照均有雜交結(jié)果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結(jié)果，背景清晰，結(jié)果可靠。證明所設(shè)計的探針準確可靠，可用于各靶序列的檢測；6.實驗

6、結(jié)果顯示，將芯片利用SPR檢測系統(tǒng)檢測，其最低檢測值可達10fmol/L，同目前常用的熒光素cy3為報告分子的方法相比，其靈敏度要高出500倍。雜交時間在16小時可獲得滿意的雜交效果。特異性檢測顯示該芯片特異性強，與更改堿基的探針無雜交；7.臨床樣品檢測結(jié)果顯示，陽性探針點及陽性對照點均有顯影結(jié)果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結(jié)果，結(jié)果可靠。檢測結(jié)果與常規(guī)經(jīng)典檢測鑒定方法結(jié)果一致，證明本檢測方法準確可靠，可用于臨床樣品的檢測。

7、 結(jié)論：基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新的核酸檢測實驗技術(shù)，具有快速、敏感、高效、高通量等優(yōu)點，已逐漸應(yīng)用于DNA測序、基因表達譜分析、基因多態(tài)性分析、藥物開發(fā)、基因診斷等多個領(lǐng)域。目前通用的基因芯片技術(shù)有多種，但都存在著靈敏度不高，檢測技術(shù)復(fù)雜，條件和設(shè)備要求高等問題，限制了該技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用。本實驗自行研究構(gòu)建了基于表面等離子體共振(SPR)原理的病原體快速檢測基因芯片。實驗結(jié)果表明：該芯片檢測技術(shù)靈敏度高，特異性