siRNA抑制促淋巴管新生因子基因表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究.pdf

1、近來(lái)發(fā)現(xiàn)VEGF-C、VEGFR-3與淋巴管生長(zhǎng)及調(diào)控有關(guān)，研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性淋巴管新生因子可否誘導(dǎo)淋巴管發(fā)生，新生的淋巴管在癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，分子調(diào)控敲出導(dǎo)致淋巴管新生因子的基因表達(dá)可否成為控制淋巴管轉(zhuǎn)移的治療方法等，對(duì)改變胃癌的治療方案具有深遠(yuǎn)意義。 本文研究了VEGF-C/VEGFR-3細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控淋巴管新生因子對(duì)胃癌淋巴管侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)，為分子治療胃癌淋巴

2、結(jié)轉(zhuǎn)移提供新的思路和理論，開(kāi)拓新的治療方法。　　目的：研究VEGF-C和VEGFR-3在胃癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。siRNA干擾胃癌細(xì)胞內(nèi)源性VEGF-C的基因和蛋白表達(dá)；含有shRNA質(zhì)粒體內(nèi)阻斷胃癌實(shí)體腫瘤組織中VEGF-C基因及蛋白表達(dá)，進(jìn)行siRNA治療胃癌有效性的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。　　方法：1994年4月-2003年12月手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本，根據(jù)胃癌數(shù)據(jù)庫(kù)登記以及隨訪的結(jié)果，按照是否有淋巴

3、結(jié)轉(zhuǎn)移分為2組，每組性別、年齡、腫瘤部位、大體類(lèi)型、病理組織學(xué)分類(lèi)、浸潤(rùn)深度、漿膜侵襲、根治程度、腹膜播散、遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異，用VEGF-C、VEGFR-3、CD34單克隆抗體用DAB法免疫組化染色，用Kaplan-meier法，Logistc和CoxRegression分析對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響。體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC7901，用nest-PCR進(jìn)行VEGF-C基因的擴(kuò)增，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，制備感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒

4、定、擴(kuò)增，鑒定、克隆和測(cè)序VEGF-C基因的表達(dá)和序列。NCBIGenebank中VEGF-C基因(genebankNo.BC035212)與所克隆基因進(jìn)行序列同源性比較，選擇Ganbank的VEGF-C的AccessionNoBC035212用Sfold軟件設(shè)計(jì)siRNA引物，設(shè)計(jì)了5條針對(duì)VEGF-C基因的不同部位的siRNA，并進(jìn)行同源性檢索，通過(guò)化學(xué)方法合成。pcDNA3.1/His/lacZ(β-半乳糖醛酸酶)質(zhì)粒為報(bào)告基因，

5、用肝癌細(xì)胞株HepG2成功建立siRNA建立轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。分別用Lipofectamin2000；TOPfect轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pcDNA3.1/His/lacZ質(zhì)粒，siRNA、pcDNA3.1/His/lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，用干擾效果最好的引物，分別觀察siRNA濃度分別為0.2μg；40μg；60μg和轉(zhuǎn)染以后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)轉(zhuǎn)染率的變化，用熒光定量PCR和westernblotting檢測(cè)VEGF-C的mRNA

6、和蛋白表達(dá)變化。Westernblotting的VEGF-C抗體根據(jù)GenBank：NM005429.ReportsHomosapiensvasc...[gi：19924300]TheoreticalpI：7.77/Mw(averagemass)：46883.37/Mw(monoisoTOPicmass)：46851.90]為第一抗體。pshRNA-VEGF-C重組質(zhì)粒干擾胃癌組織VEGF-C表達(dá)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，首先設(shè)計(jì)候選的siRNA

7、序列和shRNA表達(dá)載體，將設(shè)計(jì)的核苷酸序列全合成，psilencer2.0-U6質(zhì)粒用HindⅢ和ECoRⅠ酶切，鑒定。酶切產(chǎn)物電泳，進(jìn)行膠純化。VEGF-C-shRNA片段和psilencer載體連接、轉(zhuǎn)化以及克隆鑒定，組成pshRNA-VEGF-C重組質(zhì)粒。大量擴(kuò)增質(zhì)粒，進(jìn)行提取，進(jìn)行定量或純度檢測(cè)。核酸濃度大于90％，用取適量的pshRNA-VEGF-C重組質(zhì)粒與TOPvivo混合，制備的pshRNA-VEGF-C重組質(zhì)粒-TO

8、Pvivo復(fù)合物用于體內(nèi)導(dǎo)入。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c-nu/numice裸小鼠，4-5周齡，體重15士2g，雌雄兼有。在無(wú)特定病原體((SPF)級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)。隨機(jī)分為4組①對(duì)照組(n=12)②5-FU治療組(n=12)③空質(zhì)粒組(n=12)④ShRNA質(zhì)粒治療組(n=12)。胃癌細(xì)胞株SGC7901裸鼠皮下移植模型制作成功6周以后，取皮下胃癌組織塊，建立胃癌原位移植模型，將切割成為1mm3大小，2塊進(jìn)行胃原位移植。原位瘤接種3周以后開(kāi)始

9、經(jīng)裸鼠尾靜脈高壓注射給藥，以0.1cm/kg液體量，經(jīng)尾靜脈穿刺，5秒鐘內(nèi)注入。間隔1次/5day，連續(xù)給藥10次。5-FU劑量：30mg/kg，TOPvivo包裹空質(zhì)粒，pshRNA-VEGF-C重組質(zhì)粒劑量分別為50μg，對(duì)照組注射生理鹽水，以0.1cm/kg劑量注射。觀察指標(biāo)：自然死亡率，成瘤率，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，轉(zhuǎn)移度，病理組織學(xué)檢查，H-E染色，RTQ-PCR和Westernblotting觀察VEGF-C和VEGFR-3基因和蛋