反義TIMP-1表達質(zhì)粒對實驗性肝纖維化影響的體外研究.pdf

1、背景:肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ),是臨床向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié).目前研究認為肝纖維化屬于可逆性病變.HSC在肝纖維化過程中居核心地位,HSC體外活化過程可以模擬肝纖維化的體內(nèi)發(fā)展過程.該研究旨在構(gòu)建反義TIMP-1真核細胞表達質(zhì)粒,并應用陽離子脂質(zhì)體將其攜帶導入大鼠HSC中,檢測外源質(zhì)粒在HSC中的表達,同時體外觀察外源質(zhì)粒對實驗性肝纖維化的影響,這可能有助于為將來臨床慢性肝病肝纖維化的治療

2、提供新的有效途徑.方法:根據(jù)大鼠TIMP-1全基因cDNA序列設(shè)計PCR擴增用套式引物,運用巢式RT-PCR及基因重組技術(shù)擴增TIMP-1片段,分離、回收和純化TIMP-1 PCR產(chǎn)物,經(jīng)與T載體連接后轉(zhuǎn)染JM-109大腸桿菌,通過IPTG/X-gal藍白篩選后構(gòu)建T載體克隆-PT/TIMP-1,再從中切下目的片段,反向插入到真核細胞表達質(zhì)粒pcDNA3中,即構(gòu)建了真核細胞表達質(zhì)粒pcDNA3/反義TIMP-1,再轉(zhuǎn)染JM-109菌株.

3、通過酶切鑒定及DNA測序分析證實TIMP-1反義真核細胞表達質(zhì)粒構(gòu)建成功.大量提取大量提取質(zhì)粒.應用含I型膠原酶和鏈絲菌蛋白酶E的肝臟灌注液原位灌注肝臟,通過梯度離心方法,離心后得到HSC,應用臺盼藍拒染法辨別細胞活力,計數(shù)后培養(yǎng).細胞爬片后應用免疫組化方法檢測細胞Desmin和α-SMA表達,證實所分離的細胞系肝星形細胞.通過脂質(zhì)體將該反義表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠HSC內(nèi),以G418篩選陽性細胞克隆;同時以脂質(zhì)體攜帶熒光蛋白表面質(zhì)粒pEGF

4、P轉(zhuǎn)染HSC,并用熒光顯微鏡觀察細胞,評估轉(zhuǎn)染效率.運用Northern blot方法檢測外源導入質(zhì)粒在HSC中的表達情況;運用Western blot法檢測HSC中TIMP-1蛋白質(zhì)水平的表達、HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量;通過FITC-標記的Ⅰ型膠原底物測定HSC培養(yǎng)上清液中間質(zhì)膠原酶活性的改變情況.實驗結(jié)果采用SPSS軟件作方差分析(多樣本均數(shù)的兩兩比較).結(jié)論:反義TIMP-1真核細胞表達質(zhì)?？擅黠@抑制HSC中TIMP-1的表達,