反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的體外研究.pdf

1、背景和目的：肝纖維化(hepaticfibrosis)是多種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，是臨床向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)。目前的研究認(rèn)為肝纖維化屬于可逆性病變。 肝纖維化是由于肝損傷持續(xù)存在，組織發(fā)生修復(fù)時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)合成和降解失衡而引起的病理改變。過(guò)度沉積的ECM不僅是由于合成增多，更大程度是由于后期降解減少引起。它涉及復(fù)雜的細(xì)胞和分子機(jī)制的動(dòng)態(tài)過(guò)程。其中起主導(dǎo)作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(

2、matrixmetalloproteinase，MMPs)-金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMPs)系統(tǒng)。其中，間質(zhì)膠原酶MMP-1(人)/MMP-13(鼠)主要降解Ⅰ、Ⅲ型膠原，TIMP-1可廣泛抑制MMPs的活性。在正常肝臟，二者維持著動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，在各種致病因素的作用下，導(dǎo)致二者作用失衡，引起以膠原為主的ECM降解減少，沉積于肝臟，引發(fā)肝纖維化。 肝纖維化的

3、必經(jīng)環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSC)的激活，轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)。MFB隨著肝纖維化進(jìn)展最終轉(zhuǎn)變成為纖維細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程中將分泌大量的ECM。HSC在體外培養(yǎng)可以自行活化，模擬了體內(nèi)肝纖維化的過(guò)程，是很好的肝纖維化模型。HSC活化后合成和分泌大量的ECM和TIMP-1，后者抑制了MMPs的活性，減少了ECM的降解，促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)展。由于HSC所處的核心地位，HS

4、C成為了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究旨在分離和培養(yǎng)大鼠HSC，以脂質(zhì)體包埋反義TIMP-1表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，導(dǎo)入體外培養(yǎng)的大鼠HSC，并篩選陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)免疫組化檢測(cè)TIMP-1、MMP-13蛋白的表達(dá)，纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)，RIA法檢測(cè)透明質(zhì)酸(HA)，Ⅲ型前膠原氨端肽(PⅢNP)表達(dá)的改變。探討基因治療肝纖維化的可行性和有效性，為今后肝纖維化的基因治療提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法：1、大鼠HSC的分離和培養(yǎng)：健康W

5、istar大鼠，麻醉后原位以HBSS沖洗肝臟，接著以膠原酶、鏈霉蛋白酶灌注，分離肝臟，剪碎，消化，過(guò)濾，密度梯度離心，得到HSC。Desmin免疫組化染色鑒定； 2、G418最佳篩選濃度的確定：將G418配制成0-600ug/ml的液體，加至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，培養(yǎng)11d，以7-10d90％細(xì)胞致死劑量為最佳篩選濃度，故確定450ug/ml為大鼠HSC最佳篩選濃度，維持量為200ug/ml； 3、Lipofectamine20

6、00脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并篩選HSC：Lipofectamine2000脂質(zhì)體包埋反義TIMP-1佃cDNA3.1(+)表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HSC，48h后，以確定的G418最佳篩選濃度450ug/ml篩選，培養(yǎng)18天后，獲得陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性克隆培養(yǎng)； 4、結(jié)果觀察：免疫組化檢測(cè)TIMP-1、MMP-13蛋白的表達(dá)，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)半定量檢測(cè)其蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱。每組細(xì)胞中計(jì)數(shù)3000個(gè)細(xì)胞中所含纖維細(xì)胞總數(shù)。

7、RIA法檢測(cè)透明質(zhì)酸(HA)，Ⅲ型前膠原氨端肽(PⅢNP)表達(dá)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中計(jì)量資料采用SPSS11.0軟件作單因素方差分析(多樣本均數(shù)的兩兩比較)，計(jì)數(shù)資料采用SPSS11.0作x2檢驗(yàn)。 結(jié)果：1、大鼠HSC分離和培養(yǎng)成功；2、肝纖維化組，空質(zhì)粒組，反義TIMP-1質(zhì)粒組TIMP-1蛋白表達(dá)的灰度均值為121.573±5.969，122.507±5.326，142.197±7.887；MMP-13蛋白表達(dá)的灰度均值為15

8、5.719±9.512，158.598±11.380，178.162±5.941；PⅢNP表達(dá)的濃度均值為54.237±8.429,58.213±6.967，32.143±9.478；HA蛋白表達(dá)的濃度均值為185.306±8.861，182.277±6.447，78.615±5.269。肝纖維化組與空質(zhì)粒組相比纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)P值結(jié)果為0.492，肝纖維化組、空質(zhì)粒組與反義TIMP-1質(zhì)粒組相比纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)P值結(jié)果分別為0.000，0.0

9、00；反義TIMP-1質(zhì)粒組與肝纖維化組、空質(zhì)粒組相比，TIMP-1、MMP-13、PⅢNP、HA蛋白表達(dá)及纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少(P＜0.05)，肝纖維化組與空質(zhì)粒組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1、大鼠HSC分離和培養(yǎng)成功； 2、反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能夠抑制肝星狀細(xì)胞中TIMP-1的表達(dá)3、反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒對(duì)肝星狀細(xì)胞中的MMP-13的