ITP中自身抗體介導(dǎo)的非補體依賴的血小板凋亡研究.pdf

1、研究背景:
　　 免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是一種免疫介導(dǎo)的、臨床較為常見的血小板減少性出血性疾病，近年來其發(fā)病機制取得了一些較為重要的進展。自身抗體致敏的的血小板被單核巨噬系統(tǒng)破壞是眾所周知的經(jīng)典的發(fā)病機制，血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)特異性的自身抗體，大部分主要為針對GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ的IgG，該抗體與血小板膜自身GP抗原結(jié)合，通過作用于單核巨噬細胞Fcγ受體(FcγR)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被

2、巨噬細胞吞噬而過度清除;近來研究還發(fā)現(xiàn)自身抗體介導(dǎo)的巨核細胞成熟障礙也是導(dǎo)致外周血血小板減少的重要原因之一。然而，有學(xué)者通過小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，抗GPⅠb/Ⅸ抗體引起ITP中血小板的破壞可能是通過一種Fc段非依賴機制。也有研究提示在HIV-1相關(guān)的ITP患者，HIV-1抗體作用于血小板整合糖蛋白GPⅢa49-66可誘導(dǎo)非補體依賴作用的血小板微粒形成，其發(fā)病機制與活性氧(ROS)的誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)。目前，對于ITP患者血漿抗GPⅡb/Ⅲa和/或

3、GPⅠb/Ⅸ兩種特異性自身抗體導(dǎo)致血小板凋亡的體外研究，國內(nèi)外尚未見報道。
　　 目的:
　　 應(yīng)用改良MAIPA技術(shù)檢測ITP患者血漿中的特異性血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)自身抗體水平，通過蛋白A瓊脂糖親和層析柱制備和純化血漿IgG以去除補體，流式細胞術(shù)檢測ITP患者的IgG對正常血小板凋亡及血小板微粒形成的影響，并比較不同類型膜糖蛋白特異性自身血小板抗體在非補體依賴條件下對正常血小板的作用。

4、　　 方法:
　　 收集慢性ITP患者，通過改良單克隆特異性俘獲血小板抗原技術(shù)(MAIPA)對血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ)特異性自身抗體進行檢測。
　　 通過蛋白A瓊脂糖親和層析柱制備和純化血漿IgG，采用分光光度法對純化的IgG進行濃度的測定。
　　 收集正常人血小板并計數(shù)，1×107血小板/管，各管分別加入純化IgG抗體2mg（GPⅡb/Ⅲa單陽，GPⅠb/Ⅸ單陽，雙陽，正常人）及不含Ig

5、G的緩沖液。37℃含5％CO2孵箱中共孵育4小時。
　　 通過線粒體膜電位改變，PS外翻及血小板微粒形成三種途徑，進行流式細胞術(shù)檢測血小板凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 應(yīng)用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測血小板凋亡，流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):GPⅠb/Ⅸ抗體陽性ITP患者的血漿純化IgG可促進正常血小板凋亡(Ⅱ組:30.35±19.17％)明顯高于GPⅡb/Ⅲa抗體陽性者（Ⅰ組:9.47±9.70％，p＜0.05）、健康對

6、照（control組:10.52±12.0％，p＜0.05）及空白對照(buffer組:12.13±18.51，p＜0.05)。GPⅡb/Ⅲa抗體陽性ITP患者的血漿純化IgG對血小板凋亡與健康對照無顯著差異，p＞0.05。
　　 通過檢測磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，應(yīng)用AnnexinV試劑盒檢測血小板凋亡，進一步證實了上述結(jié)果。
　　 通過PE-cy5-CD61標記血小板進行流式細胞儀檢測，X軸代表熒光強度，Y軸代表前向

7、光散射(FSC)，我們可觀察到GPⅠb/Ⅸ抗體陽性血漿純化IgG可促進血小板微粒(PMP)形成，即熒光強度降低，細胞顆粒減?。á蠼M:53.0±23.3％vscontrol組:31.3±18.5％，p＜0.05）。GPⅡb/Ⅲa抗體及GPⅠb/Ⅸ抗體雙陽的患者血漿純化IgG、GPⅡb/Ⅲa抗體單陽性的患者血漿純化IgG對血小板微粒形成與健康對照無顯著差異，p＞0.05。
　　 患者GPⅠb/Ⅸ抗體陽性的血漿純化IgG和正常人的血漿

8、純化IgG，分別與血小板共同孵育后，通過CD62P-FITC和CD63-PE共同標記血小板，進行流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，GPⅠb/Ⅸ抗體陽性ITP患者血漿純化IgG對血小板活化與健康對照無顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 ITP患者血小板膜糖蛋白GPⅠb/Ⅸ特異性自身抗體可通過非補體依賴途徑介導(dǎo)血小板凋亡，而GPⅡb/Ⅲa特異性自身抗體無此作用。
　　 GPⅠb/Ⅸ抗體陽性ITP患者血漿，其血漿純化IgG可促進血