生物材料的表面特性對細(xì)胞行為的影響.pdf

1、天然的組織中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是由纖維狀蛋白與凝膠樣基質(zhì)構(gòu)成的精密有序的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。其在不同的組織中或同一組織的不同發(fā)育階段組成構(gòu)造有所不同，為細(xì)胞提供了豐富的信息環(huán)境。組織工程致力于研制具有卓越的生物學(xué)性能的3D結(jié)構(gòu)支架對受損組織進(jìn)行修復(fù)。在此，支架不僅能代替天然細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供生長環(huán)境，還能刺激體內(nèi)固有的修復(fù)機制來重建損傷組織并使其恢復(fù)原有功能。本論文結(jié)合材料的表面修飾及材料的表面形貌兩個方面，研究了材料的表面特性對細(xì)胞增殖及

2、細(xì)胞分化的影響。
　　 應(yīng)用于組織修復(fù)領(lǐng)域的生物材料必須具備植入體內(nèi)反應(yīng)可控，可預(yù)測，無毒，無抗原，無刺激，無遺傳毒性，無致癌物等特性;且在不同的應(yīng)用中材料需滿足不同的要求。某些材料可通過表面修飾的方法改善其生物相容性。在材料表面修飾的研究中，我們采用末端分別修飾馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺的PEG鏈作為交聯(lián)劑，將含有RGD序列的短肽分子共價修飾到表面含氨基的殼聚糖材料表面。殼聚糖是一種天然幾丁質(zhì)的衍生物，被廣泛應(yīng)用于組織工程，且經(jīng)過

3、脫乙酰作用，殼聚糖主鏈上含有許多活性基團(tuán)，如氨基和羥基，故其表面可進(jìn)一步功能化以改良其性能。同時，通過靜電紡絲的方法可制備不同排列的殼聚糖納米纖維，納米纖維可以模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)，其排列方式能影響細(xì)胞的形貌，而修飾RGD后能有效提高纖維支架上細(xì)胞的活性。
　　 除了殼聚糖等天然材料外，可降解的聚酯類材料也是組織工程中廣泛研究的一大類聚合物生物材料。近來，在眾多聚酯材料中，由細(xì)菌合成的聚3-羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)由于其具備

4、良好的生物相容性，被廣泛關(guān)注。然而，與多數(shù)聚酯高分子材料類似，PHBV表面疏水且不具備促進(jìn)細(xì)胞粘附的活性位點。因此，有必要改變PHBV膜表面性質(zhì)，引入活性生物分子以促進(jìn)細(xì)胞粘附及增殖。由于PHBV表面無任何活性位點，故可通過氨等離子體處理的方法引入氨基后再進(jìn)行修飾。在氨等離子體處理后，可在PHBV表面產(chǎn)生氨基，后經(jīng)與PEG交聯(lián)劑的反應(yīng)可將含RGD序列的短肽接枝到表面。這一修飾方法能很好地保留RGD序列的生物活性，增加修飾后材料的細(xì)胞相容

5、性;同時，修飾過程中引入的PEG鏈能有效減少材料表面的非特異性蛋白吸附，從而降低植入體內(nèi)后血栓形成的可能性。
　　 除了材料表面的化學(xué)基團(tuán)能改善材料的生物相容性，材料的表面形貌也能影響表面細(xì)胞的行為。在材料表面形貌對細(xì)胞行為影響的研究中，我們在材料表面構(gòu)筑了三維納米孔結(jié)構(gòu)以及二維微米級化學(xué)圖案，選擇了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同形貌的表面的分化。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于肌肉，滑膜，脂肪組織和骨髓等組織中

6、，是一類具有較強的自我增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞，非常適用于細(xì)胞治療和組織修復(fù)。
　　 生物高分子材料表面納米結(jié)構(gòu)制備的方法主要有納米壓印法，直寫成型法以及膠體晶體模板法等方法，不同的方法各有利弊，分別適用于不同的場合。在此，我們使用二氧化硅納米球排列的膠體晶體模板可簡便地制備聚苯乙烯反蛋白石結(jié)構(gòu)膜。聚苯乙烯材料性質(zhì)穩(wěn)定且對無毒性，常用于制備細(xì)胞培養(yǎng)耗材。其制得的反蛋白石結(jié)構(gòu)膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解損壞，是研究膜表面納米結(jié)構(gòu)與細(xì)胞

7、之間相互作用的良好材料。本實驗中，于聚苯乙烯膜表面制備的納米孔直徑為90.32±8.52nm，間距為132.61±40.3nm，排列不完全規(guī)則。在其上培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可在不依賴成骨誘導(dǎo)液的條件下誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。避免了成骨誘導(dǎo)液中某些化學(xué)成分，如地塞米松與β-甘油磷酸鈉等對細(xì)胞的刺激。同時，在反蛋白石結(jié)構(gòu)膜表面的細(xì)胞形態(tài)不同于平面膜表面，細(xì)胞更鋪展且具有更多偽足。推測這是由于反蛋白石結(jié)構(gòu)膜表面粗糙度較大，能提供更

8、多的細(xì)胞粘附位點。細(xì)胞骨架肌動蛋白通過細(xì)胞膜上的整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，從而激活MAPK信號通路，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。
　　 為了進(jìn)一步研究細(xì)胞骨架對間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，可通過表面二維微圖案來限制細(xì)胞的鋪展，從而影響細(xì)胞骨架的分布。通過紫外光照法可在POEGMA抗蛋白吸附膜上制備不同尺寸的高選擇性二維化學(xué)圖案，控制細(xì)胞生長區(qū)域。通過表面細(xì)胞培養(yǎng)證明所按此方法制備的微圖案具有較高的穩(wěn)定性。間充質(zhì)干細(xì)胞在大尺寸圖案

9、上鋪展而在小尺寸圖案上更趨于球形，即兩種圖案上細(xì)胞骨架分布顯著不同。同時，在成脂/成骨混合誘導(dǎo)液中，間充質(zhì)干細(xì)胞在大尺寸圖案上更趨于向成骨細(xì)胞分化而在小尺寸圖案上成骨分化不顯著。這也說明間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與細(xì)胞骨架相關(guān)，不同形貌的支架可通過控制細(xì)胞骨架的分布激活特定的信號通路從而控制細(xì)胞的分化。因此，從以上兩部分實驗可以得出，材料的表面形貌能通過影響細(xì)胞骨架的組裝及分布從而影響細(xì)胞的分化。
　　 綜上所述，表面修飾或表面微/納圖