hFIX雙篩選定點(diǎn)整合系統(tǒng)的研究及兩個(gè)整合相關(guān)蛋白的初步探索.pdf

1、第一部分 hFⅨ雙篩選定點(diǎn)整合系統(tǒng)的研究
　　血友病B(hemophilia B)是人凝血Ⅸ因子(human clotting factorⅨ，hFⅨ)缺乏所引起的一種出血性疾病。基因治療是遺傳型疾病根本的治療方法。然而遺傳病基因治療的應(yīng)用依然面臨兩難的局面。免疫原性風(fēng)險(xiǎn)和遺傳安全性為其應(yīng)用中首先需要解決的問題。在前期成功使用rep-RBE定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因方法通過小鼠尾靜脈注射方法獲得hFⅨ長時(shí)間表達(dá)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建一種含C

2、MV啟動(dòng)子-RBE元件-TK1基因的篩選標(biāo)記的人凝血因子Ⅸ表達(dá)框架的質(zhì)粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFⅨml。該質(zhì)粒和rep表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用于構(gòu)建定點(diǎn)整合于AAVS1位點(diǎn)表達(dá)人類凝血因子Ⅸ的穩(wěn)定細(xì)胞。特點(diǎn)為:攜帶有RBE順式元件可以介導(dǎo)rep蛋白依賴的AAVS1位點(diǎn)整合;Neo正篩選基因可以用G418篩選獲得整合細(xì)胞;RBE元件位于TK1基因和啟動(dòng)子之間，可以用阿昔洛韋去除沒有RBE參與的非定點(diǎn)整合細(xì)胞;最

3、后獲得定點(diǎn)整合于AAVS1位點(diǎn)穩(wěn)定表達(dá)人凝血因子Ⅸ的細(xì)胞。使用該質(zhì)粒制備穩(wěn)定表達(dá)人類凝血因子Ⅸ的穩(wěn)定細(xì)胞，一方面正負(fù)雙重篩選可以防止細(xì)胞隨機(jī)突變導(dǎo)致的非整合細(xì)胞耐藥對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群純凈度的影響，提高表達(dá)效率;另一方面可以有效預(yù)防插入突變導(dǎo)致的基因突變和癌蛋白表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)。通過常規(guī)分子生物學(xué)方法取代人類凝血因子Ⅸ表達(dá)框架可以構(gòu)建表達(dá)其它基因的具有定點(diǎn)整合以及正負(fù)篩選的質(zhì)粒。
　　第二部分靶向作用ZNF403基因的microRNAs鑒定

4、r>　　目的:篩選靶向調(diào)控ZNF403基因的microRNAs。
　　方法:利用生物信息學(xué)miRNA靶基因預(yù)測軟件miRWalk，預(yù)測能調(diào)控ZNF403的miRNAs。構(gòu)建ZNF403基因3'UTR熒光素酶報(bào)告載體，通過雙熒光素酶活性測定，初步分析可能調(diào)控ZNF403基因表達(dá)的miRNAs。使用Real-time PCR方法，在mRNA水平檢測miRNAs對ZNF403基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:miRNA靶基因預(yù)測軟件

5、miRWalk針對ZNF4033'UTR預(yù)測能調(diào)控ZNF403的miRNAs有65個(gè);根據(jù)生物信息預(yù)測結(jié)果和文獻(xiàn)分析篩選出4個(gè)miRNAs: miR-23，miR-135，miR-199，let-7。然后針對這4個(gè)候選miRNAs與ZNF4033'UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，雙熒光素酶活性測定結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組無顯著差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-time PCR結(jié)果與熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論: miR

6、-23，miR-135，miR-199，let-7g對ZNF403沒有抑制功能，ZNF4033'UTR不存在這4種microRNA的靶點(diǎn)。
　　第三部分 D-box附近泛素化位點(diǎn)突變對Cdc20介導(dǎo)的Sp100蛋白降解的影響
　　后期促進(jìn)復(fù)合體/細(xì)胞周期體(Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome，APC/C)是一種泛素連接酶，在有絲分裂結(jié)束時(shí)以及細(xì)胞周期G1期，APC/C靶向細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白

7、的降解[1，2]。共激活因子Cdc20結(jié)合到關(guān)鍵有絲分裂底物上，經(jīng)APC/C將其泛素化而誘導(dǎo)降解。Sp100作為PML-NBs結(jié)構(gòu)的重要組成蛋白，參與了抗病毒，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)胞凋亡等重要的細(xì)胞活動(dòng)。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)Cdc20介導(dǎo)Sp100通過泛素-蛋白酶體途徑降解，且Sp100中的D-box在底物識(shí)別過程中具有重要作用。然而，在PML和DAXX中都存在典型的D-box序列，但是，這兩種蛋白都不能被Cdc20所識(shí)別降解，提示了D-box可

8、能還需要一些特異性的側(cè)翼序列才能被Cdc20識(shí)別，而且Sp100的D-box在物種間并不保守。本研究中，我們構(gòu)建了一系列含D-box的Sp100截?cái)囿w和點(diǎn)突變來探討Cdc20底物識(shí)別的必要序列。研究發(fā)現(xiàn)GFP-Sp100(152-182 aa)截?cái)囿w包含D-box但是不能被APC/C-Cdc20降解。GFP-Sp100(151K→G)突變體將潛在泛素結(jié)合位點(diǎn)突變后，Sp100降解顯著受到抑制。但是，遠(yuǎn)離D-box的潛在泛素化位點(diǎn)破壞后對