TALE酶介導(dǎo)的基因定點整合及原位修復(fù)研究.pdf

1、同源重組介導(dǎo)的基因定點整合以及原位修復(fù)是比較理想的基因編輯方式。但是由于細胞中內(nèi)在的同源重組效率很低，所以這兩種策略的應(yīng)用在研究中還并不普及。類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)的出現(xiàn)，可能會大幅度推進這類定點基因編輯技術(shù)的發(fā)展。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上，探討TALENs以及我們自主設(shè)計改造的類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物切口酶(Transc

2、ription activator-like effector nickases，TALENickases)在促進細胞同源重組效率方面的作用。
　　第一章 TALE酶促進rDNA區(qū)定點整合研究
　　目的:探索TALENs和TALENickases促進多拷貝rDNA位點轉(zhuǎn)基因定點整合的能力及其細胞毒性方面的區(qū)別，以評估TALE酶應(yīng)用于rDNA區(qū)基因打靶的可行性。
　　方法:(1)為了在轉(zhuǎn)染細胞后實時觀察定點整合效率，我們

3、構(gòu)建了一個能夠?qū)o啟動子GFP序列定點靶入rDNA區(qū)的基因打靶載體;(2)我們將該打靶載體聯(lián)合TALENs或者TALENickases表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，在不同的時間點通過流式細胞儀檢測各組合的GFP陽性細胞比例;(3)另外單用TALENs或者TALENickases表達載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染后第三天通過AnnexinⅤ-FITC/PI復(fù)染的方式檢測各自的細胞毒性;(4)在此基礎(chǔ)上，我們使用攜帶外源基因F9的rD

4、NA區(qū)打靶載體pHrnF9(插入片段為5.4kb)聯(lián)合TALENs或者TALENickases共轉(zhuǎn)染HT1080細胞，經(jīng)G418篩選后挑取抗性克隆。通過PCR、Southern blot對抗性克隆進行鑒定。并通過RT-PCR、Elisa檢測轉(zhuǎn)基因的表達。
　　結(jié)果:(1) TALENs和TALENickases均能夠刺激GFP在rDNA區(qū)的高效定點整合。但隨著連續(xù)培養(yǎng)的進行，TALENs組的GFP陽性細胞比例會顯著降低，而TALE

5、Nickases組則不會像前者一樣急劇變化;(2) AnnexinⅤ-FITC/PI復(fù)染的結(jié)果顯示TALENs與TALENickases相比具有顯著的高毒性特征;(3) HT1080細胞打靶結(jié)果顯示TALENickases能夠顯著促進5.4kb片段的定點整合效率，最高達0.62％，轉(zhuǎn)基因能夠有效表達，而TALENs的促進作用不明顯。該方法促進定點整合的轉(zhuǎn)基因能夠有效表達。
　　結(jié)論:對多拷貝的rDNA位點來說，TALENickas

6、es更適合用來促進轉(zhuǎn)基因的定點整合。
　　第二章人凝血因子Ⅷ基因22號內(nèi)含子倒位型iPSCs的原位修復(fù)研究
　　目的:建立一種針對人凝血因子Ⅷ基因(F8)22號內(nèi)含子倒位型血友病A(hemophiliaA，HA)的基因原位修復(fù)策略，并在病人特異性誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中進行驗證。
　　方法:(1)收集22號內(nèi)含子倒位型HA患者的尿液，分離培養(yǎng)其中的腎小

7、管上皮細胞并將其誘導(dǎo)成iPSCs;(2)針對該類型HA構(gòu)建含有原位修復(fù)插入序列的基因打靶質(zhì)粒，同時設(shè)計針對修復(fù)位點的TALENs并驗證切割活性;(3)使用原位修復(fù)載體聯(lián)合TALENs對病人特異性iPSCs進行基因打靶，篩選抗性克隆，通過定點整合PCR、Southern blot進行鑒定;(4)獲得確定打靶的克隆后，再將其消化成單個細胞并核轉(zhuǎn)染pCAG-Cre。連續(xù)培養(yǎng)后挑取單細胞形成的克隆，通過PCR、Southern blot檢測確定

8、篩選基因PGK-Neo表達框已被完全切除;(5)將修復(fù)前的iPSCs以及原位修復(fù)并完全切除PGK-Neo表達框的克隆定向分化成內(nèi)皮細胞，通過RT-PCR檢測修復(fù)前后人凝血因子Ⅷ基因的表達情況。
　　結(jié)果:(1)成功建立了一株22號內(nèi)含子倒位型的HA患者特異性iPSCs。該細胞株能夠表達各種多能性標志蛋白，能夠在小鼠體內(nèi)通過形成畸胎瘤的方式分化成三胚層的組織，并保持正常二倍體核型;(2)構(gòu)建了用于原位修復(fù)F8基因22號內(nèi)含子倒位突變