2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩90頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、促進(jìn)外源治療基因定點(diǎn)整合至宿主基因組,既能克服隨機(jī)插入所導(dǎo)致的功能基因斷裂、原癌基因激活、染色體缺失、重排等潛在危險(xiǎn),又可以達(dá)到使治療基因長(zhǎng)期表達(dá)的目的,是較為理想的基因治療策略。腺相關(guān)病毒是一種非致病性的細(xì)小病毒,因其具有將自身基因組定點(diǎn)整合至人類染色體的特性,已被發(fā)展為基因治療載體用于許多疾病的治療。腺相關(guān)病毒的整合機(jī)制可以用于指導(dǎo)外源基因定點(diǎn)整合至人類基因組19號(hào)染色體特定區(qū)域(19q13.3-qter):AAVSl位點(diǎn),因此對(duì)腺

2、相關(guān)病毒的整合機(jī)制的研究也具有重要的意義。目前已知腺相關(guān)病毒的Rep68/78蛋白為介導(dǎo)定點(diǎn)整合所必需,而病毒基因組中所需的與整合相關(guān)的核心順式元件尚無(wú)定論。普遍認(rèn)為ITR是腺相關(guān)病毒整合所需順式元件,近年來(lái)有研究表明P5整合效率元件(P5IEE)也可介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生依賴于Rep蛋白的高效定點(diǎn)整合。 我們以EGFP和Neo基因?yàn)閳?bào)告基因構(gòu)建了一系列攜帶不同整合順式元件的質(zhì)粒,與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,通過(guò)對(duì)細(xì)胞克隆形成

3、效率及基因組整合位點(diǎn)的Southernblot檢測(cè)來(lái)確定腺相關(guān)病毒定點(diǎn)整合系統(tǒng)的核心順式元件。我們發(fā)現(xiàn)在Rep蛋白存在的情況下,16bp的RBE元件即可以介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生針對(duì)AAVSl位點(diǎn)的整合,并且位于ITR內(nèi)的RBE(rrR)元件比位于P5IEE內(nèi)的RBE(p5)元件具有更高的效率及位點(diǎn)專一性,這一發(fā)現(xiàn)提示了RBE很可能是腺相關(guān)病毒具有定點(diǎn)整合能力的根本原因。對(duì)P5整合效率元件(P5IEE)的缺失分析表明隨著P5IEE從5’端逐漸缺失,

4、介導(dǎo)克隆形成和定點(diǎn)整合的效率都有所下降,尤其是前89bp缺失后介導(dǎo)克隆形成效率與完整的P5IEE相比出現(xiàn)顯著差異,介導(dǎo)整合的特異性也明顯下降,說(shuō)明P5IEE中前89bp中具有與整合相關(guān)的結(jié)構(gòu)或序列。對(duì)整合質(zhì)粒與基因組接合區(qū)序列特征的分析表明質(zhì)粒斷裂部位多位于RBE序列附近;部分質(zhì)粒與基因組接合點(diǎn)附近插入了不同長(zhǎng)度的未知DNA序列。這些結(jié)構(gòu)特征與野生型腺相關(guān)病毒整合至基因組時(shí)的序列特征相似,說(shuō)明RBE順式元件所介導(dǎo)的質(zhì)粒定點(diǎn)整合與野生型腺

5、相關(guān)病毒整合是通過(guò)同一套整合機(jī)制。 為了進(jìn)一步在活體實(shí)驗(yàn)中探討是否可以通過(guò)此定點(diǎn)整合系統(tǒng)使治療基因定點(diǎn)整合至小鼠基因組內(nèi),長(zhǎng)期表達(dá)功能蛋白,我們以凝血因子IX(hFIX)為報(bào)告基因構(gòu)建了攜帶整合順式元件ITRRBE的質(zhì)粒,通過(guò)尾靜脈液壓法將此質(zhì)粒與rep基因表達(dá)質(zhì)粒一起導(dǎo)入攜帶AAVSl的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。質(zhì)粒pRBE—CMVhFIX與rep基因表達(dá)質(zhì)粒共注射后hFIX在小鼠體內(nèi)高水平表達(dá),l天時(shí)hFIX表達(dá)水平為2588~203

6、ng/m1血漿,此后開(kāi)始逐漸下降,80d后穩(wěn)定在150~204ng向l水平,持續(xù)時(shí)間超過(guò)240天;與不攜帶任何整合元件的對(duì)照質(zhì)粒pN2一CMVhFIX相比,對(duì)照組起初同樣得到高水平的hFIX表達(dá),之后迅速下降,150天后血漿中已基本檢測(cè)不到hFIX蛋白。PCR的結(jié)果顯示DNA注射后1天hFIXDNA在多組織中都有分布;30天時(shí)觀察到對(duì)照組外源DNA丟失的速度要高于pRBE—CMVhFIX注射組,除了肝臟外,其余器官hFIX信號(hào)均已大幅度

7、減弱;240d時(shí)對(duì)照組所有器官中都檢測(cè)不到hFIXDNA特異帶,而pRBE-CMVhFIX注射組在心、肝、腎中仍能檢測(cè)到hFIXDNA。對(duì)各組織RT一PCR的檢測(cè)反映hFIX主要在小鼠肝臟中長(zhǎng)期表達(dá),時(shí)間超過(guò)240天。谷草及谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平與病理切片檢測(cè)表明除尾靜脈液壓法造成的短期急性肝損傷現(xiàn)象以外沒(méi)有觀察到Rep蛋白引起另外的細(xì)胞毒性。 本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了在Rep蛋白存在的情況下,16bp的RBE元件即可以介導(dǎo)質(zhì)粒發(fā)生針對(duì)A

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論