基于人血清白蛋白與明膠的醫(yī)用軟組織粘合劑的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療水平的迅速提高，用于人工器官、外科修復(fù)或理療修復(fù)的生物醫(yī)學(xué)材料受到越來越多的重視。應(yīng)用于各種組織修復(fù)的輔助縫合制品或單獨應(yīng)用于組織閉合的軟組織粘合劑也得到了廣泛的關(guān)注。目前國內(nèi)應(yīng)用于臨床的軟組織粘合劑主要有纖維蛋白類及氰基丙烯酸酯類，而國外在基于上述兩種類型粘合劑的基礎(chǔ)上還研究開發(fā)了一種作為輔助性止血材料應(yīng)用于急性A型主動脈夾層修復(fù)的軟組織粘合劑，商品名為BioGlue。它以提純的質(zhì)量分數(shù)為45％的牛血清白蛋白(bovine s

2、erum albumin，BSA)與質(zhì)量分數(shù)為10％的戊二醛為組成成分，使用時，按照體積比4∶1的比例由特定的雙筒注射器在待修復(fù)處進行適量涂抹。BSA中帶有側(cè)鏈伯胺基的賴氨酸、待修復(fù)處的組織蛋白及戊二醛的醛基之間發(fā)生親核加成反應(yīng)，從而產(chǎn)生化學(xué)性封閉作用而達到輔助治療的目的。然而，隨著BioGlue臨床應(yīng)用的不斷增加，針對它的不良反應(yīng)報告也逐日增多，諸如局部組織壞死、血栓癥、器官功能衰竭等。因此，研制開發(fā)一款新型的醫(yī)用軟組織粘合劑勢在必行

3、。
　　本課題以國外已上市產(chǎn)品BioGlue為參照，旨在研制一種新型醫(yī)用軟組織粘合劑，以豐富國內(nèi)醫(yī)用粘合劑的市場。選取人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、明膠及戊二醛為基本組成成分，通過對各種醫(yī)用軟組織粘合劑配方的篩選、體外理化性能測定、體外毒性測定，并對篩選出的粘合劑進行了體內(nèi)系統(tǒng)性的功能評價，包括材料的體內(nèi)降解率、體內(nèi)生物相容性以及急性全身毒性，明確優(yōu)于BioGlue或與之各方面性能相當(dāng)?shù)男滦歪t(yī)用軟

4、組織粘合劑。
　　1新型軟組織粘合劑組成成分及濃度、比例的篩選
　　借鑒前人研究基礎(chǔ)，以國外上市產(chǎn)品BioGlue為對照，固定各種蛋白質(zhì)與戊二醛的體積比4∶1，通過測定膠凝時間，分別篩選出合適的蛋白質(zhì)濃度與戊二醛濃度，以此確定每一種新型軟組織粘合劑的組成。實驗確定的各組樣品分別為:對照樣品S1為BioGlue，即組成為45％的BSA溶液與10％的戊二醛溶液;樣品S2為45％的HSA溶液與10％的戊二醛溶液;樣品S3為26％的

5、明膠溶液與4％的戊二醛溶液;樣品S4為含16％尿素的26％的明膠溶液與8％的戊二醛溶液;樣品S5為比例為7∶1的混合蛋白質(zhì)溶液（45％的HSA與26％的明膠組成，下同）與8％的戊二醛溶液;樣品S6為比例為6∶2的混合蛋白質(zhì)溶液與6％的戊二醛溶液;樣品S7為比例為5∶3的混合蛋白質(zhì)溶液與5％的戊二醛溶液。
　　2篩選出的軟組織粘合劑體外理化性能的測定
　　參照YY/T0729《組織粘合劑粘接性能試驗方法》及前人研究基礎(chǔ)，將粘合

6、劑粘接于刮去脂肪層的豬皮條塊一端，利用電腦式單柱拉力試驗機進行粘合強度的測定。將中間帶有一個針孔的豬小腸黏膜固定于壓力測試機上，涂抹軟組織粘合劑形成一個密封的薄膜，通過測定使薄膜針孔處破裂的最大壓力來判定粘合劑的密封效果。家兔心臟取血后抗凝，并用其進行各組粘合劑對兔血的溶血性考察。結(jié)果表明，S2、S3、S5的傷口閉合強度與密封效果均與對照BioGlue無顯著性差異，表明這三個樣品的理化性能與BioGlue相似;而S4、S6、S7的理化性

7、能則弱于BioGlue。溶血率實驗則表明，所有的實驗組及對照組粘合劑均不表現(xiàn)溶血性。
　　3各種軟組織粘合劑浸提液對小鼠成纖維細胞L929的體外毒性評價
　　參照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分:樣品制備與參照樣品》中的規(guī)定，對各種軟組織粘合劑按照1g/5mL培養(yǎng)基的比例進行2倍于規(guī)定濃度的浸提，37℃浸提24h。通過預(yù)實驗與前人研究，采用每孔7000個細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，于給藥48h后進行M

8、TT檢測;采用每孔2×106個細胞的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，于給藥24h后進行細胞周期檢測。結(jié)果表明，S2、S6、S7對細胞增殖的抑制情況與對照組無顯著性差異，表明這三個樣品與BioGlue對細胞的毒性相當(dāng)，而S3、S4、S5對細胞增殖的抑制情況與對照組存在顯著性差異，其中S3、S5毒性較低，S4毒性較高。所有樣品組與對照組均將細胞周期阻滯于G2期，表明樣品組及對照組均對細胞存在一定的體外毒性，還需要通過動物體內(nèi)實驗進行系統(tǒng)性考察。

9、
　　4各種軟組織粘合劑在大鼠及小鼠體內(nèi)的生物學(xué)評價
　　基于各種軟組織粘合劑體外理化性能與細胞毒性的測定結(jié)果，繼續(xù)對樣品組與對照組粘合劑進行體內(nèi)評價。具體參照GB/T14233《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分:生物試驗方法》與GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評價國家標(biāo)準》，系統(tǒng)考察軟組織粘合劑在Wistar大鼠體內(nèi)的降解情況及生物相容性，以及浸提液對昆明小鼠的急性全身毒性。研究結(jié)果表明，所有含HSA的樣品組S2

10、、S5、S6、S7及含BSA的對照組S1的體內(nèi)降解率均較低，考察12w后降解仍不到40％，但蛋白質(zhì)成分單純?yōu)槊髂z的樣品S3、S4則表現(xiàn)出相對較高的降解率，12w后降解可達90％以上。HE染色結(jié)果表明，所有樣品組及對照組炎癥反應(yīng)均逐漸降低，12w后幾乎觀察不到炎癥反應(yīng)的存在;VG染色結(jié)果表明，埋植一段時間后，所有組別的大鼠均有皮下纖維囊增生的情況出現(xiàn)，隨著時間的延長，均表現(xiàn)為致密且囊壁變薄;急性全身毒性結(jié)果表明，所有樣品組及對照組均無明顯

11、的急性全身毒性。
　　本研究取得的主要研究成果有:
　　(1)通過參考已上市產(chǎn)品BioGlue的配方及國內(nèi)外關(guān)于醫(yī)用粘合劑的研究，設(shè)計出幾種基于HSA與明膠的醫(yī)用軟組織粘合劑，并通過測定其膠凝時間來篩選各種粘合劑中HSA、明膠及戊二醛的最適濃度及比例。
　　(2)參照YY/T0729《組織粘合劑粘接性能試驗方法》，利用電腦式單柱拉力試驗機，測定各種軟組織粘合劑在豬皮上的粘合強度;同時利用壓力機測定各種粘合劑的密封效果。

12、研究表明，S2、S3、S5的傷口閉合強度及密封性與對照BioGlue相比均無顯著性差異，而S4、S6、S7的傷口閉合強度與密封性則與對照存在顯著性差異，且均低于對照組。而溶血率實驗則表明所有粘合劑均不會產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。這提示我們S2、S3、S5可能會有比較好的體外及體內(nèi)相容性與順應(yīng)性。
　　(3)評價了各種軟組織粘合劑對小鼠成纖維細胞L929的體外毒性，包括MTT法測定其對細胞增殖的抑制及流式細胞術(shù)測定浸提液對L929細胞周期的影響

13、兩部分。研究表明，S2、S6、S7對細胞增殖的抑制情況與對照組相比無顯著性差異，表明這三個樣品與BioGlue對細胞的毒性相當(dāng)，而S3、S4、S5對細胞增殖的抑制情況與對照組相比則存在顯著性差異，其中S3、S5毒性較低，S4毒性較高。流式結(jié)果則表明所有樣品組與對照組均將細胞周期阻滯于G2期，表明所有粘合劑均對細胞存在一定程度的毒性作用。
　　(4)對各種軟組織粘合劑在Wistar大鼠及昆明小鼠的體內(nèi)作用情況進行了考察。結(jié)果顯示，對

14、于體內(nèi)降解而言，單純含有明膠的樣品S3、S4更優(yōu)于對照S1，其他樣品則與S1相當(dāng);對于體內(nèi)生物相容性而言，在12w的考察期內(nèi)，所有樣品組大鼠均表現(xiàn)出與對照組類似的炎癥變化及纖維囊增生變化過程;對于急性全身毒性而言，所有實驗組與對照組小鼠體重均逐日增加，未見任何不良反應(yīng)，可以初步認為各組粘合劑浸提液基本安全，對任何性別的小鼠均不存在急性全身毒性。
　　結(jié)果表明，通過測定膠凝時間篩選出合適的組分及比例，進一步測定理化性能、體外毒性、體