基于人血清白蛋白與明膠的醫(yī)用軟組織粘合劑的研究.pdf

1、隨著醫(yī)療水平的迅速提高，用于人工器官、外科修復(fù)或理療修復(fù)的生物醫(yī)學(xué)材料受到越來越多的重視。應(yīng)用于各種組織修復(fù)的輔助縫合制品或單獨(dú)應(yīng)用于組織閉合的軟組織粘合劑也得到了廣泛的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用于臨床的軟組織粘合劑主要有纖維蛋白類及氰基丙烯酸酯類，而國(guó)外在基于上述兩種類型粘合劑的基礎(chǔ)上還研究開發(fā)了一種作為輔助性止血材料應(yīng)用于急性A型主動(dòng)脈夾層修復(fù)的軟組織粘合劑，商品名為BioGlue。它以提純的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45％的牛血清白蛋白(bovine s

2、erum albumin，BSA)與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的戊二醛為組成成分，使用時(shí)，按照體積比4∶1的比例由特定的雙筒注射器在待修復(fù)處進(jìn)行適量涂抹。BSA中帶有側(cè)鏈伯胺基的賴氨酸、待修復(fù)處的組織蛋白及戊二醛的醛基之間發(fā)生親核加成反應(yīng)，從而產(chǎn)生化學(xué)性封閉作用而達(dá)到輔助治療的目的。然而，隨著BioGlue臨床應(yīng)用的不斷增加，針對(duì)它的不良反應(yīng)報(bào)告也逐日增多，諸如局部組織壞死、血栓癥、器官功能衰竭等。因此，研制開發(fā)一款新型的醫(yī)用軟組織粘合劑勢(shì)在必行

3、。
　　本課題以國(guó)外已上市產(chǎn)品BioGlue為參照，旨在研制一種新型醫(yī)用軟組織粘合劑，以豐富國(guó)內(nèi)醫(yī)用粘合劑的市場(chǎng)。選取人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、明膠及戊二醛為基本組成成分，通過對(duì)各種醫(yī)用軟組織粘合劑配方的篩選、體外理化性能測(cè)定、體外毒性測(cè)定，并對(duì)篩選出的粘合劑進(jìn)行了體內(nèi)系統(tǒng)性的功能評(píng)價(jià)，包括材料的體內(nèi)降解率、體內(nèi)生物相容性以及急性全身毒性，明確優(yōu)于BioGlue或與之各方面性能相當(dāng)?shù)男滦歪t(yī)用軟

4、組織粘合劑。
　　1新型軟組織粘合劑組成成分及濃度、比例的篩選
　　借鑒前人研究基礎(chǔ)，以國(guó)外上市產(chǎn)品BioGlue為對(duì)照，固定各種蛋白質(zhì)與戊二醛的體積比4∶1，通過測(cè)定膠凝時(shí)間，分別篩選出合適的蛋白質(zhì)濃度與戊二醛濃度，以此確定每一種新型軟組織粘合劑的組成。實(shí)驗(yàn)確定的各組樣品分別為:對(duì)照樣品S1為BioGlue，即組成為45％的BSA溶液與10％的戊二醛溶液;樣品S2為45％的HSA溶液與10％的戊二醛溶液;樣品S3為26％的

5、明膠溶液與4％的戊二醛溶液;樣品S4為含16％尿素的26％的明膠溶液與8％的戊二醛溶液;樣品S5為比例為7∶1的混合蛋白質(zhì)溶液（45％的HSA與26％的明膠組成，下同）與8％的戊二醛溶液;樣品S6為比例為6∶2的混合蛋白質(zhì)溶液與6％的戊二醛溶液;樣品S7為比例為5∶3的混合蛋白質(zhì)溶液與5％的戊二醛溶液。
　　2篩選出的軟組織粘合劑體外理化性能的測(cè)定
　　參照YY/T0729《組織粘合劑粘接性能試驗(yàn)方法》及前人研究基礎(chǔ)，將粘合

6、劑粘接于刮去脂肪層的豬皮條塊一端，利用電腦式單柱拉力試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行粘合強(qiáng)度的測(cè)定。將中間帶有一個(gè)針孔的豬小腸黏膜固定于壓力測(cè)試機(jī)上，涂抹軟組織粘合劑形成一個(gè)密封的薄膜，通過測(cè)定使薄膜針孔處破裂的最大壓力來判定粘合劑的密封效果。家兔心臟取血后抗凝，并用其進(jìn)行各組粘合劑對(duì)兔血的溶血性考察。結(jié)果表明，S2、S3、S5的傷口閉合強(qiáng)度與密封效果均與對(duì)照BioGlue無顯著性差異，表明這三個(gè)樣品的理化性能與BioGlue相似;而S4、S6、S7的理化性

7、能則弱于BioGlue。溶血率實(shí)驗(yàn)則表明，所有的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組粘合劑均不表現(xiàn)溶血性。
　　3各種軟組織粘合劑浸提液對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的體外毒性評(píng)價(jià)
　　參照GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分:樣品制備與參照樣品》中的規(guī)定，對(duì)各種軟組織粘合劑按照1g/5mL培養(yǎng)基的比例進(jìn)行2倍于規(guī)定濃度的浸提，37℃浸提24h。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)與前人研究，采用每孔7000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于給藥48h后進(jìn)行M

8、TT檢測(cè);采用每孔2×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于給藥24h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。結(jié)果表明，S2、S6、S7對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況與對(duì)照組無顯著性差異，表明這三個(gè)樣品與BioGlue對(duì)細(xì)胞的毒性相當(dāng)，而S3、S4、S5對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況與對(duì)照組存在顯著性差異，其中S3、S5毒性較低，S4毒性較高。所有樣品組與對(duì)照組均將細(xì)胞周期阻滯于G2期，表明樣品組及對(duì)照組均對(duì)細(xì)胞存在一定的體外毒性，還需要通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)性考察。

9、
　　4各種軟組織粘合劑在大鼠及小鼠體內(nèi)的生物學(xué)評(píng)價(jià)
　　基于各種軟組織粘合劑體外理化性能與細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果，繼續(xù)對(duì)樣品組與對(duì)照組粘合劑進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。具體參照GB/T14233《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分:生物試驗(yàn)方法》與GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》，系統(tǒng)考察軟組織粘合劑在Wistar大鼠體內(nèi)的降解情況及生物相容性，以及浸提液對(duì)昆明小鼠的急性全身毒性。研究結(jié)果表明，所有含HSA的樣品組S2

10、、S5、S6、S7及含BSA的對(duì)照組S1的體內(nèi)降解率均較低，考察12w后降解仍不到40％，但蛋白質(zhì)成分單純?yōu)槊髂z的樣品S3、S4則表現(xiàn)出相對(duì)較高的降解率，12w后降解可達(dá)90％以上。HE染色結(jié)果表明，所有樣品組及對(duì)照組炎癥反應(yīng)均逐漸降低，12w后幾乎觀察不到炎癥反應(yīng)的存在;VG染色結(jié)果表明，埋植一段時(shí)間后，所有組別的大鼠均有皮下纖維囊增生的情況出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，均表現(xiàn)為致密且囊壁變薄;急性全身毒性結(jié)果表明，所有樣品組及對(duì)照組均無明顯

11、的急性全身毒性。
　　本研究取得的主要研究成果有:
　　(1)通過參考已上市產(chǎn)品BioGlue的配方及國(guó)內(nèi)外關(guān)于醫(yī)用粘合劑的研究，設(shè)計(jì)出幾種基于HSA與明膠的醫(yī)用軟組織粘合劑，并通過測(cè)定其膠凝時(shí)間來篩選各種粘合劑中HSA、明膠及戊二醛的最適濃度及比例。
　　(2)參照YY/T0729《組織粘合劑粘接性能試驗(yàn)方法》，利用電腦式單柱拉力試驗(yàn)機(jī)，測(cè)定各種軟組織粘合劑在豬皮上的粘合強(qiáng)度;同時(shí)利用壓力機(jī)測(cè)定各種粘合劑的密封效果。

12、研究表明，S2、S3、S5的傷口閉合強(qiáng)度及密封性與對(duì)照BioGlue相比均無顯著性差異，而S4、S6、S7的傷口閉合強(qiáng)度與密封性則與對(duì)照存在顯著性差異，且均低于對(duì)照組。而溶血率實(shí)驗(yàn)則表明所有粘合劑均不會(huì)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。這提示我們S2、S3、S5可能會(huì)有比較好的體外及體內(nèi)相容性與順應(yīng)性。
　　(3)評(píng)價(jià)了各種軟組織粘合劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的體外毒性，包括MTT法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定浸提液對(duì)L929細(xì)胞周期的影響

13、兩部分。研究表明，S2、S6、S7對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況與對(duì)照組相比無顯著性差異，表明這三個(gè)樣品與BioGlue對(duì)細(xì)胞的毒性相當(dāng)，而S3、S4、S5對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況與對(duì)照組相比則存在顯著性差異，其中S3、S5毒性較低，S4毒性較高。流式結(jié)果則表明所有樣品組與對(duì)照組均將細(xì)胞周期阻滯于G2期，表明所有粘合劑均對(duì)細(xì)胞存在一定程度的毒性作用。
　　(4)對(duì)各種軟組織粘合劑在Wistar大鼠及昆明小鼠的體內(nèi)作用情況進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，對(duì)

14、于體內(nèi)降解而言，單純含有明膠的樣品S3、S4更優(yōu)于對(duì)照S1，其他樣品則與S1相當(dāng);對(duì)于體內(nèi)生物相容性而言，在12w的考察期內(nèi)，所有樣品組大鼠均表現(xiàn)出與對(duì)照組類似的炎癥變化及纖維囊增生變化過程;對(duì)于急性全身毒性而言，所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠體重均逐日增加，未見任何不良反應(yīng)，可以初步認(rèn)為各組粘合劑浸提液基本安全，對(duì)任何性別的小鼠均不存在急性全身毒性。
　　結(jié)果表明，通過測(cè)定膠凝時(shí)間篩選出合適的組分及比例，進(jìn)一步測(cè)定理化性能、體外毒性、體