慶大霉素脂質體抗菌骨治療兔慢性感染性骨缺損的實驗研究.pdf

1、細菌生長主要以浮游和貼附兩種形式進行。細菌貼附于實體表面后一方面進行分裂增殖，另一方面分泌胞外多糖基質，將細菌包裹于基質內，形成細菌生物膜。由于胞外基質的物理和電荷屏障以及內部特殊的生態(tài)環(huán)境，細菌生物膜所致感染較浮游細菌更難防治，是包括慢性骨髓炎在內的多種慢性感染性疾病的主要病因之一。一旦細菌生物膜在骨缺損周圍骨組織、死骨、內固定或人工關節(jié)表面滋生，將導致反復發(fā)作的慢性骨髓炎，給患者帶來極大的痛苦。PMMA、Osteoset T在局部緩

2、釋抗生素，提高了骨髓炎的治愈率，但PMMA需二次手術取出，同時研究表明單純清創(chuàng)與清創(chuàng)后植入Osteoset T在骨髓炎的治愈率方面無明顯差異。此外，高濃度慶大霉素可抑制人成骨細胞和內皮細胞的增殖，從而影響骨折愈合。慢性感染性骨缺損實際上是一種合并骨缺損的慢性骨髓炎，其主要病因仍是細菌生物膜的形成。 脂質體是磷脂分散在水中定向排列而形成的囊泡，可包封抗生素，按表面電荷不同分為陽離子、陰離子和中性脂質體。研究表明，陽離子脂質體青霉素

3、對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)生物膜的抑制作用顯著強于青霉素，其機制與S.aureus生物膜帶負電荷有關；另一方面，脂質體可使包封藥物在骨髓濃聚，因此靜脈注射脂質體抗生素可增強骨感染灶局部抗生素濃度，進而消除感染。同時，脂質體可降低高濃度抗生素對成骨細胞、內皮細胞的毒性作用。然而人體網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)對血液中的脂質體具有很強的清除作用，大大降低了脂質體抗生素的半衰期，削弱其抗感染能力。由于抗生

4、素緩釋系統(tǒng)可在感染灶釋放高濃度抗生素，因此，將脂質體抗生素負載于載體在理論上可解決這一問題。但脂質體抗生素負載于載體后再釋放的抗細菌生物膜作用是否受到影響尚不明確。本研究首先制備陽離子脂質體慶大霉素，將其負載于同種異體骨和硫酸鈣，分別進行釋放實驗，并探討釋放的陽離子脂質體慶大霉素對S.aureus ATCC29213生物膜生長的抑制作用，然后構建兔慢性感染性骨缺損模型，了解S.aureus ATCC29213注射劑量對該模型的影響，并行

5、陽離子脂質體抗菌骨對兔慢性感染性骨缺損的治療作用。此外，研究還探討了脂質體抗生素靜脈注射對兔慢性感染性骨缺損的治療作用。 本課題包括四部分：1.S.aureus注射劑量對兔慢性感染性骨缺損形成的影響。2.脂質體慶大霉素靜脈注射對兔慢性感染性骨缺損的治療作用。3.陽離子脂質體抗菌骨的制備以及體外對S.aureus生物膜生長的抑制作用。4.陽離子脂質體抗菌骨對兔慢性感染性骨缺損的治療作用。 第一部分S.aureus注射劑量對

6、免慢性感染性骨缺損形成的影響 實驗方法: 1.構建兔慢性感染性骨缺損模型，制備骨缺損，微量注射器先后注入S.aureusATCC29213，注射總量分別為6x101_6x106CFU。 2.術后3w處死所有實驗兔。計算體重變化，評估肉眼觀察評分及兔放射學改變。將兔左下肢脛骨取出進行細菌學檢查，測量并計算平均每克標本中的細菌數(shù)。 主要實驗結果: 注射劑量達6×105CFU即可使所有實驗兔在肉眼觀察評

7、分、放射學檢查及細菌學檢查呈現(xiàn)出明顯感染征象。 第二部分脂質體慶大霉素靜脈注射治療免慢性感染性骨缺損的實驗研究 實驗方法: 1.不同脂質體慶大霉素的制備 三種原材料(陽、陰離子脂質體)或兩種(中性脂質體)按照一定比例混合，旋轉蒸干制成脂質膜，加入慶大霉素溶液，振蕩制成脂質懸液，超聲處理后離心去除上清中尚未包被的慶大霉素，沉淀以ddH2O重懸制成慶大霉素脂質體。 2.兔慢性感染性骨缺損模型的制備

8、 兔麻醉后消毒鋪巾，切開皮膚，暴露脛骨近端骨面，制造骨缺損，骨蠟封閉，先后注入精氨酸和S.aureus ATCC29213，縫合皮膚。造模術后行大體觀察，X線檢查，X線檢查提示慢性骨髓炎后開始治療實驗。 3.脂質體慶大霉素靜脈注射治療兔慢性感染性骨缺損 造模成功后分組進行不同脂質體慶大霉素靜脈注射治療，治療3w后處死實驗動物。處死前抽血、X檢查，處死后取左下肢近端脛骨骨髓行細菌學檢查。 主要實驗結果：

9、 對照組血細菌培養(yǎng)和骨細菌培養(yǎng)均為陽性；陽離子脂質體慶大霉素治療組血培養(yǎng)均為陰性，骨培養(yǎng)4只陰性；陰離子脂質體慶大霉素組和單獨慶大霉素治療組血培養(yǎng)呈陰性，但骨培養(yǎng)均為陽性；中性脂質體慶大霉素治療組血培養(yǎng)陰性，骨培養(yǎng)2只陰性； 第三部分陽離子脂質體抗菌骨的制備及體外對葡萄球菌生物膜的抑制作用 實驗方法: 1.陽離子脂質體抗菌骨的制備 陽離子脂質體慶大霉素的制備與第二部分相同。無菌取兔脛骨及股骨干骺端，經(jīng)脫脂

10、、脫蛋白、脫鈣后制得兔同種異體骨。將上述同種異體骨塊及硫酸鈣浸泡至陽離子脂質體慶大霉素溶液中，蒸干，60Co輻照消毒。 2.陽離子脂質體抗菌骨的體外釋放實驗 將陽離子脂質體慶大霉素抗菌骨置于微孔板，加入ddH2O，室溫振蕩。于振蕩后不同時間更換ddH2O，并將所更換出的液體以Triton X-100進行處理，測定慶大霉素濃度。 3.陽離子脂質體抗菌骨體外對葡萄球菌生物膜的抑制作用 培養(yǎng)S.aureus A

11、TCC29213生物膜。分別取釋放實驗中8個不同時相點釋放的陽離子脂質體慶大霉素溶液，并以上述8個時相點的釋放濃度配制新鮮陽離子脂質體慶大霉素、慶大霉素，將各組抗生素分別加入S.aureus ATCC29213生物膜，1h后棄去上清，加入培養(yǎng)基，并于此后每隔30min檢測每孔溶液在630nm的吸光度。計算細菌生長速率，并得出最大細菌生長速率及所需時間。 主要實驗結果： 陽離子脂質體慶大霉素抗菌骨在釋放前期具有爆發(fā)釋放效應

12、，且在釋放前期的特殊時間段所釋放的慶大霉素總百分比與(時間)1/2成線性關系(R2>0.9)。由陽離子脂質體慶大霉素抗菌骨中釋放的陽離子脂質體慶大霉素對S.aureus ATCC29213生物膜生長的抑制作用與新配制的同濃度陽離子脂質體慶大霉素無顯著差異(P>0.05)，二者在低濃度時對S.aureus ATCC29213生物膜生長的抑制作用顯著強于單獨使用慶大霉素(P<0.01)。此外，慶大霉素對S.aureus ATCC29213的

13、MIC為230.4 mg/L。 第四部分陽離子脂質體抗菌骨對免慢性感染性骨缺損的治療作用 實驗方法: 1.陽離子脂質體抗菌骨及兔慢性感染性骨缺損模型的制備與第三部分相同。 2.實驗兔分組，進行靜脈注射、手術清創(chuàng)植入抗菌骨治療。2w后行X線檢查，抽靜脈血行血液培養(yǎng)，處死后取局部骨髓組織行細菌學檢查。 主要實驗結果： 對照組沒有抗生素治療，均出現(xiàn)明顯感染，血液及骨髓培養(yǎng)均呈S.aureus陽性

14、。單獨手術植入同種異體骨或硫酸鈣組評分較A組更高，但差異不顯著(P>0.05)。單獨使用慶大霉素治療2w可使兔血液培養(yǎng)陰性，且感染評分低于對照組，二者相差顯著(P<0.05)，且全部骨髓培養(yǎng)均陽性。使用陽離子脂質體慶大霉素靜脈注射治療可有效清除血液感染，評分低于A、B、H、I組，且與上述4組相差顯著(P<0.05)，同時評分高于F、G組，相差顯著(P<0.05)，治療的6只兔中有2只骨髓培養(yǎng)陰性。采用慶大霉素同種異體骨和慶大霉素硫酸鈣治

15、療效果相似，低于F、G組(P<0.05)，治療的6只兔中有3只骨髓培養(yǎng)陰性。兩種陽離子脂質體抗菌骨療效相似，可完全清除血液、骨髓感染，感染評分低于上述各組，且相差顯著(P<0.05)。 主要結論 1.耐藥S.aureus可誘導明顯的脛骨感染性骨缺損形成，6×105 CFU/5ul的劑量不僅可使慢性骨髓炎模型制備成功率達100％，而且能夠出現(xiàn)較明顯的放射學和細菌學改變。 2.脂質體慶大霉素可有效治療慢性感染性骨缺損

16、，其中以陽離子脂質體慶大霉素效果最為明顯，中性次之，陰離子脂質體慶大霉素與單獨使用慶大霉素相同，但任何一種脂質體慶大霉素均不能完全清除感染。 3.低溫真空負壓吸引法制備陽離子脂質體慶大霉素抗菌骨并不影響所釋放的陽離子脂質體慶大霉素對S.aureus生物膜的抑制作用，且在低濃度對S.aureus生物膜抑制顯著強于單獨使用慶大霉素。 4.手術清創(chuàng)后植入陽離子脂質體慶大霉素抗菌骨對兔脛骨S.aureus慢性感染性骨缺損的治療效