納米生物材料在轉(zhuǎn)基因方法優(yōu)化及熒光標(biāo)記中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究首先針對轉(zhuǎn)基因的特殊要求,制備了殼聚糖納米顆粒、淀粉納米顆粒、磁流體等生物納米材料,并構(gòu)建了基于生物納米材料的基因載體,對常見轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行改進(jìn),獲得了幾種新的轉(zhuǎn)基因方法組合,提高了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率,這些組合方法有望在植物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用方面得到使用和推廣。其次,合成了以天然高分子為基質(zhì)的具有磁性分離和雙熒光標(biāo)記功能的雙熒光標(biāo)記磁性淀粉納米顆粒,并對細(xì)胞實(shí)時(shí)成像和分離分析進(jìn)行了研究,建立了對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的熒光標(biāo)記和分離分析方法,有望在轉(zhuǎn)基因

2、材料的后續(xù)熒光鑒定和分離分析中得到廣泛應(yīng)用。
　　 論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.生物納米材料的制備和表征
　　 利用交聯(lián)法、油包水(W/O)微乳法和化學(xué)沉淀法分別制備了殼聚糖納米顆粒(chitson nanoparticle,CSNP),淀粉納米顆粒(starch nanoparticle,StNP)和磁性納米顆粒,并通過掃描電鏡、Zeta電位粒度分析儀等手段對納米顆粒形貌、大小和分散程度進(jìn)行表征,瓊脂糖凝

3、膠電泳法對納米顆粒裝載DNA情況進(jìn)行考查。表征結(jié)果表明:殼聚糖納米顆粒呈球形,平均粒徑約為50 nm,表面光滑、球形圓整、顆粒比較均勻、分散性好,電位約為11.1 mV;淀粉納米顆粒經(jīng)多聚賴氨酸修飾后平均粒徑約為50 nm,顆粒呈圓球形,形狀規(guī)則,分散性好,不團(tuán)聚,在pH7-8時(shí)帶正電荷;磁流體納米顆粒粒徑為2～10 nm,呈針狀,大小均勻、性能穩(wěn)定、分散性好。電泳結(jié)果表明:制備的納米顆粒均能有效結(jié)合質(zhì)粒DNA,保護(hù)所結(jié)合的DNA防止D

4、nase I的酶切。
　　 2.基于殼聚糖納米顆粒動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 以質(zhì)粒pEGFP為報(bào)告基因,以殼聚糖納米顆粒為載體,利用靜電吸附的原理制備得到基因載體復(fù)合物,與COS-7細(xì)胞共培養(yǎng),考察了納米顆粒作為基因載體在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)染效果。熒光顯微鏡檢測表明pEGFP在殼聚糖納米顆粒介導(dǎo)下成功導(dǎo)入COS-7絀胞并合成了綠色熒光蛋白,納米顆粒與細(xì)胞具有良好的生物相容性,作為一種非病毒基因載體,有助于其在生物醫(yī)學(xué)

5、中的深入應(yīng)用。
　　 3.殼聚糖納米基因載體與基因槍法聯(lián)用轉(zhuǎn)基因方法研究
　　 在常規(guī)基因槍轉(zhuǎn)基因方法基礎(chǔ)上,用納米顆粒代替金粉或鎢粉而與目的基因結(jié)合形成基因載體,在基因槍的介導(dǎo)下,轉(zhuǎn)導(dǎo)了洋蔥表皮細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)了綠色熒光蛋白,殼聚糖納米顆粒成功將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞,結(jié)果表明在基因槍輔助下,殼聚糖納米顆?；蜉d體可突破植物細(xì)胞壁,將目的基因順利帶入細(xì)胞內(nèi),拓展了殼聚糖納米顆粒在植物基因表達(dá)中

6、的應(yīng)用。
　　 4.磁性納米基因載體與電擊法聯(lián)用植物轉(zhuǎn)基因方法研究
　　 針對電擊轉(zhuǎn)基因方法中電擊過程對裸露DNA的損傷影響,制備了能夠保護(hù)DNA的磁流體納米顆粒,通過在電擊過程中加入DNA-磁流體復(fù)合納米材料,順利將目的基因轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞中,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)化后的懸浮細(xì)胞,可以明顯看到綠色熒光蛋白在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)果表明納米顆?；蜉d體在電擊作用下能有效進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)。本方法利用納米顆粒作為基因載體電擊法轉(zhuǎn)化植物

7、細(xì)胞獲得成功,解決了納米基因載體通過植物細(xì)胞壁的難題。
　　 5.淀粉納米基因載體與浸花蕾法聯(lián)用植物轉(zhuǎn)基因方法研究
　　 在常見浸花蕾轉(zhuǎn)基因方法的基礎(chǔ)上,淀粉納米顆粒替代農(nóng)桿菌,作為月的基因At2g21320的轉(zhuǎn)化載體,通過常規(guī)步驟轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化得到T0代種子,經(jīng)bastar篩選后得到抗Bastar的T1代種子,比較T1代種子與野生型種子生長情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):突變體株系的開花時(shí)間明顯早于野生型的,表現(xiàn)出不同程度的矮化,最顯著的

8、表現(xiàn)是莖的縱向伸長和葉的發(fā)育受到了嚴(yán)重的影響,綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因植物的下胚軸細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明,淀粉納米顆粒與浸花蕾法聯(lián)用成功將目的基因轉(zhuǎn)入植物中,可得到穩(wěn)定表達(dá)的后代植株,聯(lián)用方法避免了微生物培養(yǎng)的繁瑣步驟,具有簡便易行的優(yōu)點(diǎn),可望成為一種新型轉(zhuǎn)基因方法。
　　 6.復(fù)合生物納米材料的制備及在細(xì)胞標(biāo)記和分離分析研究
　　 針對轉(zhuǎn)基因過程中轉(zhuǎn)基因材料的鑒定和分離分析難點(diǎn),研究了生物納米材料在細(xì)胞熒光標(biāo)記和分離分析的應(yīng)

9、用。經(jīng)過依次制備磁流體、磁性淀粉納米顆粒、修飾多聚賴氨酸磁性納米顆粒和修飾異硫氰酸熒光素和四甲基異硫氰酸羅丹明雙標(biāo)記的磁性納米顆粒四步制備得到復(fù)合生物納米材料,通過透射電子顯微鏡、納米粒度及Zeta電位分析儀、傅里葉紅外光譜儀、熱分析和磁性分析對制備的復(fù)合納米顆粒進(jìn)行表征,通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對制備納米顆粒的生物學(xué)性能和在細(xì)胞標(biāo)記和分離分析中應(yīng)用進(jìn)行考查。表征結(jié)果表明:制備的復(fù)合納米微球粒徑均勻,分散性好,平均直徑約為220 nm,有較好的熱穩(wěn)