穴位貼敷TDD藥貼對哮喘豚鼠血清IL-4、IFN-γ水平及氣道重構的影響.pdf

1、支氣管哮喘（bronchial asthma，簡稱哮喘）是由嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞參與的氣道慢性炎癥，這種炎癥使易感者對各種激發(fā)因子具有氣道高反應性，引起氣道痙攣、縮窄等，表現(xiàn)為反復發(fā)作性喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇。支氣管哮喘是當今世界上最常見的慢性氣道炎癥性疾病，據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界約有1億以上的哮喘患者，我國至少也有1-2千萬。近年來有資料顯示其發(fā)病率

2、逐年上升。由此可見，哮喘嚴重危害著人們的健康，因此，把哮喘作為一個重點、難點的課題來研究是及其重要的。近年研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的發(fā)生不僅存在著氣道炎癥，還存在著不同程度的氣道壁結構改變，即氣道重構，氣道炎癥與氣道重構是哮喘的兩個主要病理學特征。氣道重構是指廣泛的氣道結構改變，如氣道壁的增厚，基底膜變性和增厚，平滑肌的增生、肥厚，上皮下的纖維化等，氣道上皮下纖維化主要表現(xiàn)為網(wǎng)狀層密度和厚度的增加，與Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原，纖維結合蛋白以及胞外介質(zhì)的沉

3、積有關。氣道壁的增厚以及氣道平滑肌的增生、肥厚等，導致了氣道的狹窄，氣流阻力的增加和氣道高反應性。如今認為哮喘是一種Ⅰ型變態(tài)反應已取得了普遍的共識，IgE依賴的T細胞調(diào)控機制是哮喘的主要免疫學機制，認為哮喘病的發(fā)生與Th1/Th2的比例失調(diào)有關，而INF-r是一種Th1細胞因子，IL-4是一種Th2細胞因子，且IFN-γ及IL-4分別為Th1和Th2的特征性細胞因子。近幾年，通過調(diào)整Th1/Th2細胞亞群失衡來治療哮喘已成為研究的熱點，

4、而調(diào)節(jié)IL-4的水平是調(diào)整Th1/Th2失衡的重要靶點。糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過敏、調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，是目前治療哮喘的第一線藥物，但長期應用其副作用明顯。 中醫(yī)認為本病屬于“哮證”范疇，總屬本虛標實，本虛主要指腎虛，標實重點指肺實，故其病變之臟當以肺腎為要，傳統(tǒng)中醫(yī)針灸理論形成的天灸療法在治療哮喘方面有獨特的療效，現(xiàn)被廣泛應用于臨床，但所使用的多仍為中藥膏劑或即時手工制作的膏餅，劑型相對落后。基于此，本課題研發(fā)TDD藥貼，

5、并對其進行臨床前研究，TDD藥貼已由南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院制劑教研室研發(fā)成功，它是根據(jù)《張氏醫(yī)通·喘門》“冷哮方”的藥物加麻黃組成，利用現(xiàn)代藥物提純技術和藥物經(jīng)皮吸收技術制作而成的一種天灸新劑型，是中國古代天灸療法的發(fā)展，具有藥物吸收快、生物利用度高、給藥持久、副作用少的特點。用此藥貼敷貼于大椎、雙肺俞、雙腎俞，一方面這些穴位發(fā)揮宣肺平喘、化痰止咳，補腎納氣及疏通經(jīng)絡等作用，另一方面這些具有溫肺散寒、化痰止咳、宣肺平喘，辛溫走竄藥物被吸

6、收后發(fā)揮其特殊的藥理作用，從而共同達到止咳平喘化痰的作用。 目的： 通過雞卵清蛋白（OVA）生理鹽水腹腔注射致敏并霧化吸入誘喘來制作實驗性哮喘豚鼠，觀察穴位貼敷TDD藥貼對實驗性哮喘豚鼠血清IL-4、IFN-γ水平的影響以及支氣管肺組織的病理形態(tài)學改變情況，以探討穴位貼敷TDD藥貼對哮喘治療的可能療效機制，為TDD藥貼的開發(fā)和應用提供理論基礎。 方法： （1）造模：將豚鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組、

7、地塞米松組及TDD藥貼組，每組12只，共48只。除空白對照組外其余3組均用雞卵清蛋白（OVA）生理鹽水造模，其步驟如下：①致敏：第4d，用由OVA和生理鹽水配制成10%的混懸液1mL給豚鼠腹腔皮下注射，使其處于致敏狀態(tài)；②誘喘：第18d開始，將致敏的豚鼠置于密閉透明的塑料盒內(nèi)，給予1% OVA生理鹽水渾懸液霧化吸入加以激發(fā)，每次20-30 sec，隔天一次，共7次，以腹式呼吸明顯，呼吸頻率加快且節(jié)律不整，活動減少等癥狀為誘喘成功；③正常

8、對照組以生理鹽水代替OVA生理鹽水混懸液，其致敏及誘喘方法同上。 （2）治療：TDD藥貼組于第18d激發(fā)哮喘后開始給藥，每次敷藥6h，隔日1次，共給藥7次。選穴如下：大椎、雙肺俞、雙腎俞，方法如下：將豚鼠頸背部相應穴位處用寵物電剪刀剪毛，剪毛范圍：縱向大椎至腎俞，橫向脊柱兩側各旁開1.5cm，后將TDD藥貼貼敷于穴位處。地塞米松組采用腹腔注射地塞米松注射液0.5mg/kg，治療時間與次數(shù)同TDD藥貼組。模型組造模后，與TDD藥貼

9、組和地塞米松組一樣誘喘但不予其他干預措施。正常對照組除用生理鹽水模仿其他組致敏及誘喘外，不給予任何干預措施。 （3）取材：第31d，在末次致喘后2～4h內(nèi)，用3%戊巴比妥鈉，50mg/kg腹腔注射麻醉所有豚鼠，迅速斷頭取血，每只取5ml，然后室溫放置2h后，3000轉/min離心15min，取上清液，放冰箱-20℃保存待測，后嚴格按照試劑盒說明采用免疫組織化學法（ELISA）測定每組每只豚鼠血清中IL-4、IFN-γ的含量。采血

10、完畢后，取右側支氣管組織1mm×1mm大小4塊，用10%的甲醛溶液固定，12h內(nèi)石蠟包埋，冠狀切片，并行HE染色，最后由病理?？漆t(yī)生在未知實驗分組情況下，用10×40高倍視野對所有標本進行分析，觀察支氣管肺組織的病理形態(tài)學改變。 結果：在造模及治療階段：正常對照組死亡豚鼠2只，模型組死亡6只，地塞米松組死亡4只，TDD藥貼組死亡6只。 （1）采用ELISA法檢測IL-4的結果示：模型組豚鼠血清IL-4水平明顯高于正常對照

11、組、TDD藥貼組、地塞米松組（P<0.01）； TDD藥貼組、地塞米松組豚鼠血清IL-4水平高于正常對照組（P<0.05）； TDD藥貼組與地塞米松組豚鼠血清IL-4差異無顯著性意義（P>0.05）。 （2）采用免疫組織化學法檢測IFN-γ的結果示：正常對照組IFN-γ水平明顯高于其他3組（P<0.01）；地塞米松組IFN-γ水平明顯高于TDD組與模型組（P<0.01）； TDD組IFN-γ水平明顯高于模型組（P<0.01）。

12、 （3）光鏡下觀察各組哮喘豚鼠支氣管肺組織的病理形態(tài)學改變： ①正常對照組：支氣管粘膜上皮完整，平滑肌無明顯的增厚，肺泡壁清晰完整，間隔形態(tài)正常，無明顯的炎癥細胞浸潤；（附圖1） ②模型組：支氣管管壁粘膜上皮細胞受損和脫落明顯，氣道壁不完整，粘膜下層炎癥明顯，氣道平滑肌增厚，膠原纖維增加，管腔狹窄，氣道腔內(nèi)粘液分泌增多，粘液栓堵塞，氣道周圍嗜酸性粒細胞明顯增加，肺泡內(nèi)可見彌漫性慢性炎細胞浸潤、管腔變窄，肺泡基本上實

13、變，充滿了炎癥細胞，有肺大泡形成，肺泡間隔有明顯充血；（附圖2） ③地塞米松組：支氣管粘膜上皮基本完整，管壁平滑肌層有輕度的增厚，間質(zhì)炎癥細胞較少，肺泡間隔基本完整，腔內(nèi)有少量的炎癥細胞，肺泡間隙輕度充血以及有少數(shù)的炎癥細胞浸潤；（附圖3） ④TDD藥貼組：支氣管的粘膜上皮基本完整，平滑肌層有輕度的增厚，管周有少量的炎癥細胞，肺泡完整，間質(zhì)輕度充血。（附圖4） 結論： 支氣管哮喘是多種炎癥細胞和細胞因子參

14、與的慢性氣道炎性疾病，目前Th1和Th2類細胞因子失衡在支氣管哮喘發(fā)病中的作用已引起了人們的關注，IFN-γ及IL-4分別為Th1和Th2的特征性細胞因子。從實驗的結果來看，TDD藥貼可降低實驗性哮喘豚鼠血清中IL-4的水平而升高IFN-γ的水平，提示TDD藥貼對哮喘豚鼠的治療機制主要是通過阻斷或抑制Th2細胞的活化而減少IL-4的分泌，刺激Th1細胞IFN-γ的分泌，從而調(diào)整Th1/Th2的失衡狀態(tài)，來抑制氣道的炎癥反應，降低豚鼠模型