穴位貼敷TDD藥貼對哮喘豚鼠COX-2、MMP-9含量的影響.pdf

1、一、研究背景、目的與意義
　　 支氣管哮喘(后文簡稱哮喘)是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞介質(zhì)參與的呼吸道慢性炎癥。在我國哮喘是嚴(yán)重影響人們(特別是兒童和青少年)健康的常見病,據(jù)粗略統(tǒng)計,我國約有1500萬～2000萬人罹患哮喘。隨著城市化,現(xiàn)代生活的進(jìn)步,近幾年來哮喘患病率有增加的趨勢,在我國廣州,1994-2001年間,13-14歲有哮喘癥狀的兒童患病率由3.4％增加至9.

2、9％。由于哮喘病情常遷延反復(fù),病程長,故已成為世界性的健康問題而引起各國的極大關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn),哮喘的發(fā)生不僅存在著氣道炎癥,還存在著不同程度的氣道壁結(jié)構(gòu)改變,即氣道重構(gòu),氣道炎癥與氣道重構(gòu)是哮喘的兩個主要病理學(xué)特征。其中氣道重構(gòu)是引起慢性哮喘患者氣道不可逆性阻塞的病理基礎(chǔ)。氣道炎癥是哮喘產(chǎn)生高反應(yīng)的本質(zhì)因素。
　　 環(huán)氧化酶2在炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵作用,已視為快速炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一。COX-2主要存在于氣道上皮細(xì)胞和平

3、滑肌細(xì)胞,生理狀態(tài)下它幾乎不被表達(dá),只有在炎性細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)將細(xì)胞激活的情況下才被表達(dá)。哮喘患者氣道粘膜中有大量的單核-巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤,被激活后可產(chǎn)生大量的COX-2,COX-2是種炎性酶,它的表達(dá)誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá),這些炎癥介質(zhì)又加重了炎癥反應(yīng),從而誘發(fā)哮喘或使哮喘加重。
　　 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解和沉積失衡是導(dǎo)致哮喘患者氣道壁結(jié)構(gòu)異常構(gòu)建、肺實(shí)質(zhì)破壞及間質(zhì)增生的重要因?yàn)?。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬

4、蛋白酶(MMPs)是調(diào)節(jié)ECM代謝的主要限速酶。MMP-9是MMP家族的成員之一,正常狀態(tài)組織表達(dá)極少。在細(xì)胞因子刺激下MMP-9表達(dá)上調(diào),細(xì)胞外基質(zhì)降解,導(dǎo)致氣道慢性炎癥和氣道重塑。哮喘患者M(jìn)MP-9表達(dá)過度,氣道細(xì)胞外基質(zhì)受損,炎細(xì)胞向氣道局部浸潤,激活基質(zhì)的生長因子,促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、膠原沉積,最終引起氣道重塑,加重氣道炎癥。從而引起了哮喘的產(chǎn)生或加重了哮喘。
　　 中醫(yī)認(rèn)為哮喘病屬于“哮病”范疇,穴位貼敷療法是中醫(yī)治療

5、此病的較有效療法之一。穴位貼敷法古稱“冷灸”,是把藥物研成細(xì)末,用液體(如水、醋、酒、蛋清、植物油、姜汁等)調(diào)成糊狀,或?qū)⒅兴幇境筛鄤?直接貼敷于穴位。穴位貼敷作為外治療法,對人體的作用機(jī)理主要包括藥物的直接作用和藥物對俞穴刺激的間接作用兩方面。此種療法為中醫(yī)治療哮喘的常用療法之一,雖療效顯著但劑型落后。目前,有一種較新的項(xiàng)目一經(jīng)皮給藥系統(tǒng),(TDDS),其是藥物經(jīng)由皮肽吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)并達(dá)到有效血藥濃度、實(shí)現(xiàn)疾病治療或預(yù)防的一類制

6、劑。這類制劑在歐美國家習(xí)稱為貼劑,在國內(nèi)多定名為貼片,這種劑型較原有穴位貼敷劑型具有藥物吸收快、生物利用度高、攜帶方便等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察了穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼對哮喘豚鼠血清中COX-2水平的影響以及對哮喘豚鼠支氣管肺組織中MMP-9影響,從而探討穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼對治療哮喘的可能作用機(jī)制,并為今后TDD藥貼在臨床上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 二、方法與內(nèi)容
　　 1.實(shí)驗(yàn)動物與分組
　　 48只豚鼠,隨機(jī)分為

7、正常對照組、模型組、TDD藥貼組和地塞米松組,每組各12只。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1致敏:除正常對照組外,其余各組均采用雞卵白蛋白致敏,常規(guī)消毒后一次性腹腔注射100 g/L卵白蛋白生理鹽水1mL,使豚鼠處于致敏狀態(tài)。第18天開始,將致敏的豚鼠置于密閉透明的塑料盒內(nèi),給予10 g/L卵白蛋白生理鹽水渾懸液霧化吸入加以激發(fā),每次每次30 s,1次/d,連續(xù)14d以腹式呼吸明顯,呼吸頻率加快且節(jié)律不整,活動減少等癥

8、狀為誘喘成功。正常對照組以生理鹽水代替卵白蛋白生理鹽水,其致敏及誘喘時間同實(shí)驗(yàn)組。
　　 2.2治療:TDD藥貼組將TDD藥貼敷貼于豚鼠大椎、雙肺俞、雙腎俞進(jìn)行治療。地塞米松組采用穴腹腔注射地塞米松進(jìn)行干預(yù)治療。模型對照組和正常對照組不給予任何干預(yù)治療。觀察各組豚鼠哮喘發(fā)作時的癥狀輕重程度以及發(fā)作次數(shù)。
　　 2.3取材及制作標(biāo)本:在末次誘喘后2～4 h內(nèi),給豚鼠稱體質(zhì)量,用30g/L戊巴比妥鈉,按50 mg/kg腹腔注

9、射麻醉豚鼠,迅速斷頭取血,每只取5 mL,然后室溫放置2 h后,3000 r/min離心15 min,取上清液,放冰箱-20℃保存待測。在斷頭取血同時,立即迅速打開胸腔,暴露肺及心臟,常規(guī)取支氣管肺組織(右中下肺,包括肺門),避免鉗夾組織引起組織受壓影響觀察,取材部位:右中下肺取一橫切面,包括腫門。所取組織經(jīng)100ml/L多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋和切片(厚4 um),等待測量。
　　 2.4指標(biāo)檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用酶聯(lián)免疫吸

10、附法定量檢測每只豚鼠血清中COX-2水平,采用免疫組化法測定支氣管肺組織MMP-9蛋白表達(dá)。
　　 2.5統(tǒng)計方法:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSS 13.0上建立數(shù)據(jù)庫、進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計分析。各組間差異采用單向方差分析(One-WayANOVA),方差齊用LSD檢驗(yàn),方差不齊用Tamhane’s檢驗(yàn)。
　　 2.6分析數(shù)據(jù),得出結(jié)論。
　　 三、結(jié)果
　　 1.在造模及治療階段:TDD藥貼組死亡6只,模型組死

11、亡6只,地塞米松組死亡4只,正常對照組死亡豚鼠2只。
　　 2.穴位貼敷TDD藥貼對哮喘豚鼠血清中COX-2水平的影響
　　 采用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測血清中COX-2含量的結(jié)果表明:模型對照組豚鼠血清中cox-2含量顯著高于正常對照組(P<0.01,P值0.000),說明哮喘豚鼠血清中COX-2含量顯著增加,即造模成功,也表明血清中COX-2含量與哮喘密切相關(guān)。TDD藥貼組、地塞米松組豚鼠血清COX-2含量顯著低于模型

12、對照組(P<0.01,P值0.000),說明兩種治療方法均可使哮喘豚鼠血清中COX-2水平降低。而TDD藥貼組豚鼠血清中COX-2的水平與地塞米松組相比有差異(P<0.01,P值0.004),說明地塞米松腹腔注射的方法比TDD貼敷更能降低哮喘豚鼠血清中COX-2水平。
　　 3.穴位貼敷TDD藥貼對哮喘豚鼠支氣管肺組織中MMP-9水平的影響
　　 采用免疫組化法測定支氣管肺組織MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:模型對照組豚鼠支

13、氣管肺組織中MMP-9水平高于正常對照組(P<0.01,P值0.000)。經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組豚鼠MMP-9水平低于模型對照組(P<0.01,P值0.000)。經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組豚鼠血清MMP-9水平稍高于正常對照組(P<0.01,P值0.000)。經(jīng)皮給藥藥貼組與地塞米松組豚鼠MMP-9平相當(dāng),差異無顯著性意義(P>0.05,P值0.074),說明這兩種干預(yù)措施對哮喘豚鼠支氣管肺組織中MMP-9水平影響無差異。