PHBV改性及其作為軟骨組織工程支架的研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 生物玻璃復(fù)合PHBV制備PHBV/BG支架
　　目的:將親水性材料-生物玻璃(bioactive glass,BG)與聚(羥基丁酸酯-羥基戊酸酯)(poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate),PHBV)混合制備PHBV/BG復(fù)合材料,評(píng)價(jià)復(fù)合材料的親水性、生物相容性及多孔支架材料的物理特征。
　　方法:采用“劑澆鑄-粒子析出法”將一定量(

2、10％和20％質(zhì)量百分比)的生物玻璃與PHBV混合后制備PHBV/10％BG和PHBV/20％BG三維多孔支架材料及片狀材料,通過(guò)靜態(tài)水接觸角法和吸水率檢測(cè)并比較單純PHBV及PHBV/生物玻璃復(fù)合材料的親水性;通過(guò)細(xì)胞粘附率檢測(cè)及掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架材料的生長(zhǎng)情況評(píng)價(jià)支架的生物相容性。掃描電鏡觀察PHBV及PHBV/生物玻璃支架多孔結(jié)構(gòu)并檢測(cè)材料的彈性模量。
　　結(jié)果:PHBV分別與10％BG和20％BG復(fù)合后,復(fù)合材料的孔徑

3、、孔隙率與單純PHBV相比無(wú)明顯差異。水接觸角從65±1.3°降低至52±2.5°和32±1.5°,彈性模量從0.16±0.03MPa增加到0.22±0.09MPa、0.41±0.09MPa,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與單純PHBV相比,細(xì)胞在復(fù)合材料上的粘附率明顯提高,并隨著復(fù)合材料中 BG含量的增加而增加。掃描電鏡觀察示細(xì)胞在支架上粘附良好。
　　結(jié)論: BG與PHBV復(fù)合可以改善PHBV材料的的親水性,提高材料對(duì)細(xì)

4、胞的粘附能力及力學(xué)性能。PHBV/BG復(fù)合支架具有良好的生物相容性和多孔支架結(jié)構(gòu)。
　　第二部分 PHBV/BG復(fù)合軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程化軟骨
　　目的:將軟骨細(xì)胞接種到PHBV和PHBV/20％BG和支架上,體外培養(yǎng)后植入裸鼠皮下培養(yǎng),觀察期體內(nèi)成軟骨能力,評(píng)價(jià)PHBV/20％BG作為軟骨組織工程支架材料的可行性。
　　方法:將熒光標(biāo)記的軟骨細(xì)胞分別接種至PHBV和PHBV/20％BG支架上,培養(yǎng)4h和12h后熒光顯

5、微鏡觀察細(xì)胞在支架上的分布情況。將PHBV和PHBV/20％BG制成浸提液培養(yǎng)軟骨細(xì)胞,并行CCK檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將軟骨細(xì)胞接種到PHBV和PHBV/20％BG支架上分別作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,體外培養(yǎng)1周、2周、3周后行軟骨細(xì)胞DNA定量檢測(cè)。將體外培養(yǎng)3周的細(xì)胞-支架復(fù)合物移植到裸鼠皮下繼續(xù)培養(yǎng),至4周,8周,12周取材行組織學(xué)染色,細(xì)胞外基質(zhì)成分(膠原、GAG)定量檢測(cè)及彈性模量測(cè)定。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡觀察顯示與 PHBV

6、支架相比,軟骨細(xì)胞接種至PHBV/20％BG支架后向支架內(nèi)部遷徙的速度更快,在支架內(nèi)部分布的更為均勻。CCK檢測(cè)顯示經(jīng)PHBV/20％BG浸提液培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖速度更快。體外培養(yǎng)期間,實(shí)驗(yàn)組新生組織軟骨細(xì)胞DNA含量較對(duì)照組明顯更多,且實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下培養(yǎng)新生組織在支架內(nèi)分布更為均勻,厚度更厚,軟骨結(jié)構(gòu)更為成熟,且細(xì)胞外基質(zhì)成分(膠原、GAG)含量和彈性模量更高。
　　結(jié)論:BG與PHBV復(fù)合有利于軟骨細(xì)胞在支架內(nèi)均勻分布及增殖,

7、與PHBV相比,以PHBV/20％BG為支架構(gòu)建的組織工程化軟骨質(zhì)量更好。
　　第三部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化以及與軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng)
　　目的:體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)并通過(guò)添加誘導(dǎo)劑或與軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng)兩種方式,誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。 方法:抽取兔髂骨骨髓后采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs并在光鏡下觀察,采用抗兔 CD29、CD10

8、5、CD166單克隆抗體行流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。取原代及傳代BMSCs貼壁培養(yǎng),采用CCK檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制生長(zhǎng)曲線。使用軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑、成骨誘導(dǎo)劑量及脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs三相分化,并行相應(yīng)的組織學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)。將BMSCs與PLA/PGA支架復(fù)合后置于transwell室內(nèi),分別放于含有DMEM培養(yǎng)液(對(duì)照組)和貼壁軟骨細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)8周,植入裸鼠皮下繼續(xù)培養(yǎng)6周,行RT-PCR檢測(cè)和組織學(xué)染色。
　　

9、結(jié)果:骨髓采用密度梯度離心法分離獲得細(xì)胞,第2代細(xì)胞CD29、CD105、CD166的陽(yáng)性率分別為為70％±10％、77％±8％、45％±8％。經(jīng)軟骨化、骨化及脂肪化誘導(dǎo)后,相應(yīng)的特異性染色均呈陽(yáng)性,RT-PCR檢測(cè)分別有Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原及aP2基因的表達(dá)。BMSCs-支架復(fù)合物與軟骨細(xì)胞體外隔離共培養(yǎng)后有新生軟骨樣組織形成,RT-PCR檢測(cè)顯示基質(zhì)含有Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。裸鼠皮下培養(yǎng)6周后實(shí)驗(yàn)組可以形成良好的軟骨樣組織,組織學(xué)染色示

10、新生組織有軟骨陷窩結(jié)構(gòu),基質(zhì)富含GAG和Ⅱ型膠原,對(duì)照組新生組織皺縮,無(wú)軟骨樣組織形成。
　　結(jié)論:密度梯度離心法可以獲得純度較好的BMSCs,添加軟骨化誘導(dǎo)劑及與軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng)的方式均能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。
　　第四部分 PHBV/BG復(fù)合BMSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究PHBV/20％BG支架復(fù)合BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果,探討PHBV/20％BG作為軟骨組織工程支架

11、的可行性。
　　方法:分離培養(yǎng)兔自體BMSCs后接種至PHBV/20％BG支架體外培養(yǎng)3天。將20只健康新西蘭大白兔的20個(gè)膝關(guān)節(jié)隨機(jī)分為A組、B組、C組,每組10個(gè)膝關(guān)節(jié)(B組和C組共用1個(gè)關(guān)節(jié))。于股骨髁關(guān)節(jié)面非負(fù)重區(qū)制作軟骨缺損模型,缺損直徑5mm、深度3mm。A組植入BMSCs-PHBV/20％BG復(fù)合物,B組關(guān)節(jié)缺損處植入PHBV/20％BG支架,C組為空白組不作處理。術(shù)后12周觀察軟骨缺損區(qū)的修復(fù)情況,缺損區(qū)組織分別取