Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠種植體骨結(jié)合中的應(yīng)用研究.pdf

1、種植義齒是目前最為理想的口腔缺牙修復(fù)方式，但由于骨結(jié)合不良，T2DM患者種植義齒的失敗率顯著高于健康缺牙患者。有研究表明T2DM種植體周圍成骨相關(guān)細(xì)胞的成骨分化能力受到抑制是骨結(jié)合不足的關(guān)鍵因素，因此，提高成骨相關(guān)細(xì)胞的成骨分化能力是解決T2DM骨結(jié)合不良的根本途徑。Sema3A是新發(fā)現(xiàn)的極具特色的骨保護(hù)因子，能夠同時(shí)有效的促進(jìn)成骨分化和抑制破骨分化，可能是較為理想的提高種植體骨結(jié)合的分子。因此，本研究首先采用了殼聚糖薄膜作為載體將Se

2、ma3A負(fù)載到鈦種植體表面，體外觀察了其促進(jìn)成骨分化的效應(yīng)。
　　近些年來，由于ASCs具有來源廣泛、取材方便、傷害性小等優(yōu)勢，是極為理想的干細(xì)胞來源，而基于ASCs的膜片技術(shù)被認(rèn)為是極富前景的組織修復(fù)技術(shù)，目前尚未見應(yīng)用于種植體周圍的報(bào)道。與此同時(shí)，對于ASCs成骨分化能力目前尚存在諸多爭議，多數(shù)認(rèn)為ASCs的骨基質(zhì)礦化作用和鈣沉積尚不能滿足T2DM患者種植修復(fù)的臨床需求，因此有必要提高ASCs的成骨能力以應(yīng)用于種植體周圍。因此

3、，本研究隨后擬采用Sema3A修飾ASCs，檢測Sema3A對于ASCs形態(tài)、增殖及成骨能力的影響，并通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí) Sema3A修飾的 ASCs膜片包裹到種植體周圍對T2DM大鼠種植體骨結(jié)合的作用。
　　第一部分、Sema3A修飾的種植體表面對成骨細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用
　　目的：觀察Sema3A修飾的種植體表面對成骨細(xì)胞行為的影響。
　　方法：鈦種植體采用MAO處理，利用硅烷偶聯(lián)劑將殼聚糖和Sema3A混合物

4、共價(jià)結(jié)合到MAO鈦種植體表面，根據(jù)種植體表面加載復(fù)合物的不同分為四組：CS/sema-MAO、CS/BSA-MAO、CS-MAO和MAO。將成骨細(xì)胞MG63直接接種到不同試樣表面，培養(yǎng)2小時(shí)后采用DAPI染色觀察細(xì)胞粘附數(shù)量；培養(yǎng)1、3、7天后采用MTT檢測細(xì)胞活力；成骨誘導(dǎo)3、7天后采用RT-qPCR檢測成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、OCN、BMP的表達(dá)；成骨誘導(dǎo)21天后采用茜素紅檢測礦化形成。
　　結(jié)果：經(jīng)Sema3A修飾后

5、的MAO種植體對成骨細(xì)胞粘附能力與對照組無顯著差別；在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞活力無明顯影響；誘導(dǎo)3天后RUNX2表達(dá)提升3倍以上，其余基因表達(dá)提升了2倍以上，誘導(dǎo)7天后RUNX2無顯著提升，但其余基因表達(dá)提升到3倍以上；茜素紅染色顯示Sema3A修飾后的種植體能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化能力。
　　結(jié)論：Sema3A修飾的種植體表面能夠顯著提升成骨細(xì)胞的成骨分化能力。
　　第二部分、Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響

6、
　　目的：觀察Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響。
　　方法：調(diào)整Sema3A在培養(yǎng)液中的終濃度為0、0.25、0.5、1.0μg/ml，對應(yīng)實(shí)驗(yàn)的4個(gè)組：ASC組；ASC-0.25組；ASC-0.5組；ASC-1.0組。采用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性；RT-qPCR技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響；ALP染色、天狼星紅染色、茜素紅染色觀察ALP活性、膠原分泌和礦化程度。
　　

7、結(jié)果：
　　（1）Sema3A對于 ASCs形態(tài)變化無明顯影響。
　　（2）Sema3A劑量的改變未對ASCs增殖能力產(chǎn)生影響。
　　（3）隨著Sema3A濃度的增加，成骨分化相關(guān)基因ALP、COL1等表達(dá)明顯升高。
　?。?）隨著Sema3A濃度的增加，ALP表達(dá)和膠原分泌增加；茜素紅染色可見Sema3A干預(yù)組鈣結(jié)節(jié)生成較空白ASCs組增加，但各個(gè)濃度之間差異不明顯。
　　結(jié)論：Sema3A對于ASCs形

8、態(tài)變化、增殖能力均影響不大，但能夠顯著增強(qiáng)ASCs的成骨分化能力，且Sema3A濃度的增加，促進(jìn)作用也增強(qiáng)。
　　第三部分、Sema3A修飾的ASCs膜片對T2DM大鼠種植體骨結(jié)合的作用
　　目的：觀察Sema3A修飾后的ASCs膜片對于T2DM種植體骨結(jié)合的影響。
　　方法：高脂高糖飼料喂養(yǎng)+小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)T2DM大鼠，采用含不同濃度Sema3A（0、0.25、0.5、1.0μg/ml）的成膜誘導(dǎo)液培養(yǎng)誘導(dǎo)

9、ASCs形成膜片并包裹種植體形成膜片-種植體復(fù)合物，將膜片-種植體復(fù)合物植入T2DM大鼠脛骨近骺端，4周、8周后取材分別行Micro-CT掃描及Van Gieson染色分析。
　　結(jié)果：誘導(dǎo)成功的T2DM大鼠隨機(jī)血糖較穩(wěn)定，且均>16.7mmol/l；倒置光學(xué)顯微鏡下可見膜片誘導(dǎo)成功，刮取后回縮成球形，能很好的包裹種植體；Micro-CT掃描結(jié)果可見，隨Sema3A濃度的增加，種植體周圍新骨形成增加；組織染色可見Sema3A修飾的