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文檔簡介
1、目的:
1.研究CYR61(cysteine-rich61;CCN1)對脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(RF/6A細胞系)增殖、遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)的影響。
2.研究CYR61在糖尿病小鼠和正常小鼠視網(wǎng)膜的表達和分布情況及其差異。
3.研究增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者玻璃體CYR61的表達水平,以及CYR61在視網(wǎng)膜增殖膜內(nèi)的表達和分布。
方法:
1.通過MTT比色實驗觀
2、察CYR61對RF/6A細胞增殖能力的影響;應(yīng)用Transwell小室觀察CYR61作用下,RF/6A細胞遷移能力的變化;采用Matrigel基質(zhì)膠,觀察CYR61對RF/6A細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的影響。
2.腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制作糖尿病小鼠模型,通過免疫組織化學(xué)方法觀察CYR61在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的表達和分布,利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法分析視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達情況。
3.
3、收集玻璃體切除手術(shù)患者的玻璃體液和視網(wǎng)膜前膜,利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法測定PDR患者和非糖尿病患者玻璃體CYR61的濃度,利用免疫組織化學(xué)方法觀察CYR61在PDR、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)和特發(fā)性黃斑前膜患者的視網(wǎng)膜前膜中的表達和分布情況。
結(jié)果:
1.用不同濃度的CYR61(0,5 ng/mL,10 ng/mL,50 ng/mL,100 ng/mL,500ng/mL)干預(yù)RF/6A細
4、胞72h,隨著CYR61濃度增加,MTT比色實驗的吸光度A490nm值升高,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.000);400ng/mL Cry61干預(yù)RF/6A細胞不同時間(0,12h,24h,48h,72h),隨著時間延長,A490nm.值升高,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.000)。Transwell小室實驗中,隨著CYR61濃度增加,遷移的RF/6A細胞增加(p=0.000),400ng/ml CYR61促進細胞遷移的能力與80ng/m
5、l VEGF相當(dāng),而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。Matrigel基質(zhì)膠實驗中,隨著CYR61濃度增加,RF/6A細胞形成的管狀結(jié)構(gòu)增多(p=0.000),400ng/ml CYR61與80ng/ml VEGF的作用相當(dāng),而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。
2.在正常小鼠的視網(wǎng)膜,CYR61在神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、外從狀層和光感受器層均有表達,其中外從狀層表達較強,其余各層弱陽性染色;在糖尿
6、病小鼠的視網(wǎng)膜,CYR61同樣在以上各層表達,但神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層的表達較正常小鼠明顯增強,神經(jīng)節(jié)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)團塊狀的陽性染色。糖尿病小鼠視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達較正常對照組增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.009)。
3.PDR組玻璃體CYR61濃度為97.53±34.13(41.21~154.74)ng/mL,對照組玻璃體CYR61濃度為33.92±18.68(6.24~70.04)ng/mL,兩組有顯著
7、性差異(p=0.000);視網(wǎng)膜和增殖膜新生血管豐富者玻璃體CYR61明顯高于無明顯新生血管者(p=0.001);未發(fā)現(xiàn)玻璃體CYR61與患者年齡、糖尿病病程及術(shù)前空腹血糖有關(guān)(p>0.05)。CYR61分布于視網(wǎng)膜前膜的細胞胞漿中,在PDR視網(wǎng)膜前增殖膜中管腔樣結(jié)構(gòu)的管壁細胞高度表達,在其它細胞也可見散在的陽性染色;PVR視網(wǎng)膜前增殖膜及特發(fā)性黃斑前膜中,有散在的陽性染色細胞。
結(jié)論
CYR61在體外可以促
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