血小板反應(yīng)蛋白-1與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)實驗研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建含有小鼠反義血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)基因并受四環(huán)素反應(yīng)性元件調(diào)控的真核表達質(zhì)粒(pTRE2-antisenseTSP-1，pTRE2-AsTSP-1)，為構(gòu)建誘導(dǎo)抑制TSP-1表達的轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠動物模型提供工具。同時檢測增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferativediabeticretinopathy，PDR)玻璃體中TSP-1和血管內(nèi)皮生長因子(vasculare

2、ndothelialgrowthfactor，VEGF)的表達水平，以探討TSP-1和VEGF在PDR中的作用。 方法： 一、受四環(huán)素調(diào)控的反義血小板反應(yīng)蛋白-1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、從正常C57BL/6小鼠的視網(wǎng)膜中提取總RNA，上游引物含有ClaI內(nèi)切酶位點，下游引物含有BamHI內(nèi)切酶位點，行RT-PCR擴增TSP-1基因C端1.2Kb片段。 2、對pTRE2hyg質(zhì)粒和TSP-1基因的PCR產(chǎn)物

3、進行雙酶切(內(nèi)切酶為：BamHI和ClaI)，行瓊脂糖電泳分離，膠回收酶切后的載體和目的基因片段。 3、將回收的pTRE2hyg質(zhì)粒和TSP-1基因鏈接，反義TSP-1基因在質(zhì)粒多克隆基因位點的BamHI和ClaI內(nèi)切酶位點插入到pTRE2hyg中，獲得重組體pTRE2-AsTSP-1。 4、將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，大量擴增重組體。 5、利用雙酶切和測序?qū)χ亟M體進行鑒定，正確鏈接的重組體大量擴增備用。

4、 二、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中血小板反應(yīng)蛋白-1和血管內(nèi)皮生長因子的檢測 1、實驗材料：收集實驗組PDR患者23例(23眼)和對照組特發(fā)性黃斑裂孔患者6例(6眼)行玻璃體切除手術(shù)時切取的玻璃體標(biāo)本，同時記錄患者的性別、年齡、有無玻璃體積血、玻璃體切除術(shù)前是否行視網(wǎng)膜激光網(wǎng)膜光凝術(shù)。 2、TSP-1和VEGF表達的檢測：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzymelinkedimmunosorbentassa

5、y，ELISA)，檢測實驗組PDR和對照組特發(fā)性黃斑裂孔患者玻璃體TSP-1和VEGF的質(zhì)量濃度。 3、TSP-1和VEGF表達的分析：利用兩樣本間的t檢驗對實驗組和對照組玻璃體TSP-1的含量進行統(tǒng)計學(xué)分析，利用等級秩和檢驗(MannWhitney法)對實驗組和對照組玻璃體VEGF的含量進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Spearman相關(guān)檢驗進行玻璃體中TSP-1和VEGF的相關(guān)性分析。 結(jié)果： 一、受四環(huán)素調(diào)控的反義血小

6、板反應(yīng)蛋白-1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1、已構(gòu)建的pTRE2-AsTSP-1重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和ClaI內(nèi)切酶雙酶切鑒定含有長度為5.3Kb的質(zhì)粒片段和1.2Kb的TSP-1基因片段。 2、已構(gòu)建的pTRE2-AsTSP-1重組質(zhì)粒測序鑒定含有完整的反義TSP-1基因片段。 二、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中血小板反應(yīng)蛋白-1和血管內(nèi)皮生長因子的檢測 1、PDR患者玻璃體TSP-1的質(zhì)量濃度為：977.

7、73±116.03ng/mL；對照組為：861.57±84.57ng/mL。兩者差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 2、PDR患者玻璃體VEGF的質(zhì)量濃度為：1564.02±1023.51pg/mL；對照組為：246.38±186.49pg/mL，兩者差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 3、PDR患者玻璃體TSP-1與VEGF有正相關(guān)性，r=0.445，(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了pTRE2