六個(gè)新的尋常型銀屑病易感基因的鑒定.pdf

1、研究背景：
　　 銀屑病是一種臨床常見的以紅斑鱗屑為基本表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚疾病。該病發(fā)病原因不清，可能和遺傳、免疫以及各種環(huán)境因素共同作用有關(guān)。家系研究及人群流行病學(xué)研究證實(shí)了銀屑病的遺傳學(xué)發(fā)病基礎(chǔ)，早期的連鎖分析、候選基因研究及全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（Genome-Wide Association Study，GWAS）發(fā)現(xiàn)銀屑病的多個(gè)易感基因位點(diǎn)，其中多數(shù)未能被證實(shí)。目前發(fā)現(xiàn)的遺傳信號不能完全解釋銀屑病的發(fā)病機(jī)制，提示可能尚

2、有其他遺傳因素的存在。此外，中國和高加索人群GWAS結(jié)果的差異提示該病在不同人群中的易感等位基因或位點(diǎn)存在異質(zhì)性。
　　 人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）和國際單體型圖計(jì)劃(International HapMap Project，Hap2Map)的完成，為復(fù)雜疾病的易感基因研究提供了重要的生物信息和分析工具。GWAS是近幾年興起的一種搜尋復(fù)雜疾病易感基因的強(qiáng)效有力的方法，被科學(xué)界認(rèn)為是目前最為

3、有效的搜尋重大疾病易感基因的研究方法之一。
　　 本研究小組前期首次對中國人群銀屑病易感基因進(jìn)行了大規(guī)模GWAS研究。除證實(shí)高加索人群兩個(gè)已知的易感位點(diǎn)：MHC和IL12B，還發(fā)現(xiàn)了位于染色體1q21上一個(gè)新的銀屑病易感位點(diǎn)LCE基因簇。通過銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白癜風(fēng)等多個(gè)皮膚復(fù)雜疾病易感基因的GWAS研究，目前已建立了較完整的復(fù)雜疾病易感基因研究的GWAS操作平臺和統(tǒng)計(jì)分析方法，并通過建立的遺傳資源庫收集了大量的銀屑病和對

4、照樣本。
　　 本研究是在前期銀屑病易感基因GWAS研究的基礎(chǔ)上，采取六階段驗(yàn)證方法，對來自中國的8,312個(gè)病例和12,919個(gè)對照進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)對來自歐洲的3,293個(gè)病例和4,188個(gè)正常對照以及254個(gè)核心家系進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步搜尋漢族人銀屑病其他可能的易感基因位點(diǎn)。
　　 目的：
　　 進(jìn)一步搜尋中國漢族人銀屑病相關(guān)的易感基因位點(diǎn)；確定漢族人相關(guān)的銀屑病遺傳危險(xiǎn)因素；比較中國人群與高加索人群的銀屑病

5、遺傳學(xué)異質(zhì)性。
　　 方法：
　　 （一）樣本來源：
　　 驗(yàn)證1(4,610個(gè)病例和5,373名對照)和驗(yàn)證2(2,024例患者和5,495名對照)的樣本來源于全國多家合作醫(yī)院收集的漢族人群。驗(yàn)證3（539名病例和824名健康對照）的樣本，來自新疆維吾爾自治區(qū)的維吾爾族人群。驗(yàn)證4(823個(gè)病例和1,840 名對照)的樣本來自德國。驗(yàn)證5(2,470名患者和2,348名對照)的樣本及驗(yàn)證6的254個(gè)同胞對核心家

6、系來自美國。每一階段的驗(yàn)證樣本中，病例和對照均來源于同一地區(qū)和同一種族。
　　 （二）驗(yàn)證階段SNP的選?。?br>　　 本研究采用了兩種挑選SNP的方法。第一種方法，在1,139病例和1,227對照的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中挑選了21個(gè) P<10-5的SNP。第二種方法：將3496例其他自身免疫性相關(guān)疾病作為擬對照，同1,227例正常對照一起共5173例，作為共同的對照標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)分析，參與選點(diǎn)，從中選取P<10-5的40個(gè)SNP參與進(jìn)

7、一步驗(yàn)證。最終選取61個(gè)SNP參與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　 驗(yàn)證2共有35個(gè)SNP被選取分型，其中包括：1)從驗(yàn)證1中挑選的20個(gè)P<0.05的SNP；2)從高加索人群中報(bào)道銀屑病相關(guān)的8個(gè)位點(diǎn)中選取的15個(gè)SNP。
　　 （三）GWAS中基因分型和質(zhì)量控制：
　　 基于前期GWAS（包括1,139 銀屑病患者和1,132對照的620,901 SNP和CNV探針）的分型數(shù)據(jù)，加入95例新的正常對照基因分型數(shù)據(jù)以解釋數(shù)據(jù)質(zhì)

8、控。采用Cochran-Armitage trend檢驗(yàn)法計(jì)算基因型-表型的關(guān)聯(lián)性。
　　 （四）驗(yàn)證階段的基因分型和質(zhì)量控制：
　　 驗(yàn)證1-3采用Sequenom MassArray系統(tǒng)(San Diego，USA)和Biosystems TaqMan assays (USA)進(jìn)行基因分型。MALDI-TOF MS檢測等位基因。MassARRAY TYPER軟件 (Sequenom公司)完成質(zhì)譜圖分析。
　　

9、 驗(yàn)證4和5的基因分型采用TaqMan assays (Applied Biosystems)完成。數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制通過PLINK 1.05完成。
　　 驗(yàn)證6的標(biāo)本運(yùn)用 Sequenom MassArray system完成。
　　 （五）統(tǒng)計(jì)分析：
　　 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件R繪制染色體圖和Q-Q圖。PCA分析法評估有異常偏離樣本及人群分層存在。病例和對照進(jìn)行PCA分析，經(jīng)過質(zhì)量控制后，SNPs 分型數(shù)據(jù)在GWAS

10、階段進(jìn)行分析。
　　 在驗(yàn)證1-5中，分別采用Cochran-Armitage trend 檢驗(yàn)計(jì)算其關(guān)聯(lián)性。在多階段驗(yàn)證研究的合并分析中，采用固定效應(yīng)模型或隨機(jī)效應(yīng)模型分析進(jìn)行分析。家系的關(guān)聯(lián)研究采用半似然函數(shù)進(jìn)行病例對照關(guān)聯(lián)分析。
　　 多重logistic回歸分析用于檢測區(qū)域內(nèi)的信號的獨(dú)立性。
　　 在病例中采用將臨床亞型作為輸出變量的logistic 回歸分析檢測與臨床亞型有關(guān)的SNP。
　　 采

11、用異質(zhì)性檢驗(yàn)方法檢測不同組間的遺傳異質(zhì)性。
　　 結(jié)果：
　　 一、第一階段驗(yàn)證中，在漢族人群的4,610例患者和5,373例對照中對61個(gè)SNP進(jìn)行基因分型。綜合GWAS和驗(yàn)證1的結(jié)果顯示其中的4個(gè)SNP達(dá)到了全基因組顯著性標(biāo)準(zhǔn)(P<5.0×10-8)，這四個(gè)SNP分別是位于5q33.1(TNIP1/ANXA6)區(qū)域的rs3762999和rs999556（P=1.1×10-12，OR=1.24；P=4.3×10-13，

12、OR=1.24）；位于5q33.3(PTTG1)區(qū)域的rs2431697（P=1.1×10-8，OR=1.20）和位于13q12.11(GJB2)區(qū)域的rs3751385（P=1.7×10-10，OR=1.18）。
　　 二、對GWAS，驗(yàn)證1和驗(yàn)證2的綜合分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)7個(gè)區(qū)域的9個(gè)SNP達(dá)到了全基因組顯著性水平，它們分別是：位于5q15(ERAP1)的rs151823，Pcombined=9.3×10-9；位于5q33.1(

13、TNIP1/ANXA6)的rs999556和rs3762999，Pcombined分別是3.8×10-21和 4.6×10-18；位于5q33.3 (PTTG1)的rs2431697，Pcombined=1.1×10-8；位于8p23.2 (CSMD1)的rs10088247和rs7007032，Pcombined分別是4.5×10-9和3.8×10-8；位于13q12.11 (GJB2)的rs3751385，Pcombined=8.6

14、×10-8（PGWAS+Replication1=1.7×10-10)；位于18q22.1 (SERPINB8)的rs514315，Pcombined=5.9×10-9；以及位于19q13.41 (ZNF816A)的rs9304742，Pcombined=2.1×10-9。
　　 三、對維吾爾人群（驗(yàn)證3）、德國人群（驗(yàn)證4）、美國人群（驗(yàn)證5）及254個(gè)核心家系（驗(yàn)證6）的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示位于13q12.11 (

15、GJB2)的rs3751385以及位于5q15(ERAP1)的rs151823 分別在德國人群及中國維吾爾人群中與銀屑病相關(guān)（P=3.6×10-3，OR=1.26；P=2.9×10-5，OR=1.45）。ZNF816A 在漢族人群（P=2.1×10-9，OR=0.88）、中國維吾爾人群（P=1.7×10-3，OR=0.77）和德國人群中（P=7.9×10-3，OR=0.84）均顯示一致的關(guān)聯(lián)性，在美國人群（驗(yàn)證5）中提示關(guān)聯(lián)性證據(jù)(P=

16、1.6×10-2，OR=0.90)。對高加索人群（驗(yàn)證4和5）的合并分析，顯示新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)在高加索人群中均與銀屑病不相關(guān)。
　　 四、漢族人合并分型數(shù)據(jù)提示ZNF816A（rs9304742）和ERAP1（rs151823）可能與早發(fā)型銀屑病有關(guān)聯(lián)性（P=1.5×10-3，OR=0.85；P=6.5×10-3，OR=0.88）。
　　 結(jié)論：
　　 在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)了六個(gè)新的銀屑病易感位點(diǎn)，同時(shí)證實(shí)了高