家族性膀胱輸尿管反流的分子機(jī)制研究.pdf

1、膀胱輸尿管反流（Vesicoureteral reflux，VUR）是指由于輸尿管膀胱連接部異常造成的先天性泌尿系統(tǒng)畸形。這一畸形導(dǎo)致尿液由膀胱逆流到輸尿管甚至腎內(nèi)，在排尿期尤為明顯，膀胱輸尿管反流在兒童中的發(fā)病率約為1％。膀胱輸尿管反流與反復(fù)性尿路感染、腎畸形及腎疤痕相關(guān)，反流性腎病是導(dǎo)致兒童及青少年終末性腎病的常見(jiàn)原因之一。目前膀胱輸尿管反流患者根據(jù)反流嚴(yán)重程度不同可以分為Ⅰ-Ⅴ度，其中部分Ⅳ和Ⅴ度患者需要手術(shù)治療。膀胱輸尿管反流的

2、診斷金標(biāo)準(zhǔn)是排尿性膀胱尿道造影。很多膀胱輸尿管患者無(wú)臨床癥狀，利用排尿性膀胱尿道造影對(duì)每個(gè)兒童進(jìn)行篩查是不可行的。目前，膀胱輸尿管反流被公認(rèn)具有遺傳性和家族史，因此尋找膀胱輸尿管反流的致病基因，對(duì)于早期診斷，了解膀胱輸尿管反流的發(fā)病機(jī)制具有重大意義。 膀胱輸尿管反流具有家族聚集性說(shuō)明遺傳因素是其發(fā)病機(jī)制之一，其中同卵雙生的雙胞胎同時(shí)患膀胱輸尿管反流的幾率為80-100％，而異卵雙生的雙胞胎同時(shí)患膀胱輸尿管反流的幾率為35-50％

3、。如果父母雙方有一方是膀胱輸尿管反流患者，則子女的患病機(jī)率為55-66％。目前研究認(rèn)為，膀胱輸尿管反流的遺傳方式為多因子疾病或常染色體顯性遺傳但不完全外顯。在膀胱輸尿管反流家系中進(jìn)行的全基因組連鎖研究中，發(fā)現(xiàn)1p13、2q37、3q22.2-23等位點(diǎn)與膀胱輸尿管反流密切相關(guān)。 在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，后腎間質(zhì)誘導(dǎo)附近的午非氏（Wolffian）管長(zhǎng)出輸尿管芽，輸尿管芽近端與后。腎間質(zhì)相互誘導(dǎo)形成腎臟，輸尿管芽遠(yuǎn)端則形成輸尿管、輸尿

4、管膀胱連接部及膀胱三角。輸尿管芽的出芽位置能影響輸尿管在膀胱開(kāi)口的位置和膀胱輸尿管連接部的正常結(jié)構(gòu)，形成膀胱輸尿管反流。在后腎間質(zhì)誘導(dǎo)附近的午非氏管長(zhǎng)出輸尿管芽的過(guò)程中，很多基因參與了這一誘導(dǎo)過(guò)程，例如：GDNF（Glial cell line-derived neurotrophic factor），PAX-2（Paired box gene2），RET（Rearranged during transfection protoonco

5、gene）等。 在小鼠胚胎腎發(fā)育過(guò)程中，gdnf沿著午非氏（Wolffian）管表達(dá)，slit2和它的受體robo2能影響gdnf的表達(dá)，進(jìn)而影響輸尿管芽的生長(zhǎng)，基因敲除robo2或slit2的小鼠，會(huì)形成多個(gè)腎及輸尿管。美國(guó)科學(xué)家進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一例原發(fā)性膀胱輸尿管反流患者的Y染色體和3號(hào)染色體發(fā)生了易位，斷裂點(diǎn)在ROBO2基因的第一個(gè)外顯子和第二個(gè)外顯子之間。后來(lái)，他們?cè)?24個(gè)具有膀胱輸尿管反流或者是腎臟等其它泌尿系先天性畸形的家

6、系中，對(duì)ROBO2基因進(jìn)行突變掃描，在兩個(gè)不相關(guān)的家系里新發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)錯(cuò)義突變。意大利科學(xué)家在95個(gè)膀胱輸尿管反流或合并腎臟等其它泌尿系先天性畸形的病例中，對(duì)ROBO2基因進(jìn)行測(cè)序掃描發(fā)現(xiàn)了4個(gè)錯(cuò)義突變，具有較高的突變率（5.1％）。 RET基因在腎臟不同發(fā)育階段（中腎管，輸尿管芽，膀胱）廣泛表達(dá)。RET基因敲除的小鼠的輸尿管發(fā)育異常，輸尿管遠(yuǎn)端不是連接到膀胱，而是與性腺管相連。另外加拿大科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，小鼠過(guò)度表達(dá)Ret會(huì)造成

7、膀胱輸尿管反流。在加拿大魁北克居住的法國(guó)移民后代中，RET基因錯(cuò)義突變Gly691Ser與原發(fā)性膀胱輸尿管反流密切相關(guān)。 綜上所述，ROBO2、SLIT2及RET都有可能是家族性膀胱輸尿管反流的致病基因。我們收集了54個(gè)膀胱輸尿管反流家系的標(biāo)本，每個(gè)家系中至少有兩名膀胱輸尿管反流患者。本論文進(jìn)一步研究上述基因在家族性膀胱輸尿管反流發(fā)病過(guò)程中的作用。共分兩部分：第一部分從每個(gè)家系中挑選一名膀胱輸尿管反流患者，分離外周血DNA，利用

8、基因測(cè)序方法對(duì)ROBO2和SLIT2這一對(duì)基因進(jìn)行突變掃描，對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因突變進(jìn)行連鎖分析和功能預(yù)測(cè)研究。第二部分是利用Taqman基因分型技術(shù)，在54個(gè)家系的先證者及親屬、163個(gè)健康對(duì)照者中，對(duì)RET基因單核苷酸多態(tài)性rs1799939：G>A進(jìn)行基因分型，分析其是否與膀胱輸尿管反流這一疾病相關(guān)。 第一部分ROBO2和SLIT2基因在家族性膀胱輸尿管反流中的作用機(jī)制研究 目的：研究ROBO2和SLIT2這一對(duì)基因在家族

9、性膀胱輸尿管反流中的作用機(jī)制，同時(shí)進(jìn)一步明確泌尿系統(tǒng)的正常發(fā)育機(jī)制。 材料：我們從瑞典哥德堡地區(qū)收集了54個(gè)家系，每個(gè)家系均有2個(gè)或者2個(gè)以上無(wú)癥狀膀胱輸尿管反流患者，從每個(gè)家系中挑選出1名患者用于測(cè)序。我們從卡羅林斯卡大學(xué)附屬醫(yī)院收集了96個(gè)健康人的DNA作為對(duì)照，用來(lái)辨別新發(fā)現(xiàn)的基因突變是否是基因多態(tài)性。54個(gè)家系中，有17個(gè)家系存在兄弟姐妹共同患病，16個(gè)家系中是從父母遺傳，其中14個(gè)從母親遺傳。膀胱輸尿管反流的嚴(yán)重程度分

10、級(jí)：Ⅰ度：1例，Ⅱ度：5例，Ⅲ度12例，Ⅳ度17例，Ⅴ度8例，其余11例情況未明。7例先證者有重復(fù)腎輸尿管，2例有腎盂輸尿管狹窄，1例有雙側(cè)重復(fù)腎輸尿管和輸尿管末端囊腫。 方法：（1）收集54例患者的外周血，分離DNA。（2）利用Primer3軟件針對(duì)ROBO2和SLIT2兩個(gè)基因的每一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段。（3）純化PCR產(chǎn)物，去除多余的引物，分別利用正向和反向引物對(duì)相應(yīng)片段進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，然后在ABI37

11、30測(cè)序儀上進(jìn)行掃描，結(jié)果用Seqscape2.5軟件進(jìn)行分析。（5）在線軟件Homologene檢測(cè)人ROBO2和SLIT2蛋白的同源氨基酸序列，利用在線軟件BGDP Splice Site Prediction、NetGene2、GeneSplicer、HumanSplicing Finder（Version2.4）檢測(cè)基因突變對(duì)剪切位點(diǎn)的影響。利用在線軟件NNPREDICT檢測(cè)基因突變對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，利用在線軟件PolyP

12、hen檢測(cè)基因突變對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的影響。 結(jié)論：ROBO2和SLIT2基因突變與部分膀胱輸尿管反流患者的發(fā)病有關(guān)系，我們第一次在膀胱輸尿管反流患者中發(fā)現(xiàn)SLIT2基因錯(cuò)義突變，但其功能及是否也存在在其他人群中需要進(jìn)一步研究。此外，樣本數(shù)量較小也降低了發(fā)現(xiàn)致病突變的可能性。但是我們盡量采用了家族性患者作為掃描對(duì)象，以提高發(fā)現(xiàn)膀胱輸尿管反流的致病基因。ROBO2和SLIT2基因突變?cè)诎螂纵斈蚬芊戳骰颊咧猩僖?jiàn)也進(jìn)一步證明膀胱輸

13、尿管反流是一多基因疾病。 第二部分 RET基因單核苷酸多態(tài)性rs1799939：G>A與家族性膀胱輸尿管反流的相關(guān)性研究 目的：研究RET基因單核苷酸多態(tài)性rs1799939：G>A是否與瑞典家族性膀胱輸尿管反流患者的發(fā)病相關(guān)。 材料及方法：我們從瑞典哥德堡地區(qū)收集了54個(gè)家系，每個(gè)家系均有2個(gè)以上膀胱輸尿管反流患者，收集先證者及親屬共計(jì)212人的外周血，并分離DNA，另外分離163名健康人的DNA作為對(duì)照。利用