NLR家族分子和DAMP家族CRT分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、第一部分：NLR家族分子在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制
　　目的和方法：NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）是固有免疫和炎癥的重要調(diào)節(jié)分子，一部分NLRs識(shí)別相應(yīng)配體之后能夠募集Caspase-1形成一種蛋白復(fù)合物：炎性小體，進(jìn)一步促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生，另一部分NLRs參與調(diào)節(jié)NF-κB和MAPK信號(hào)通路，從而啟動(dòng)固有免疫和獲得性免疫。炎癥和腫瘤間存在著密切的聯(lián)系，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩等炎癥性腸炎是

2、誘發(fā)結(jié)直腸癌的主要病因之一。至今為止，已有很多關(guān)于 NLRs在小鼠結(jié)直腸癌模型中的研究，如 Nlrx1-/-小鼠是結(jié)腸炎以及結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型的易感小鼠；小鼠Nlrp6和Nlrp12基因的缺失都會(huì)導(dǎo)致結(jié)直腸癌進(jìn)展加快，惡性程度增高；但是有關(guān)NLR分子在人結(jié)直腸癌中表達(dá)分析的報(bào)道卻很少。鑒于此，我們1）選擇與腫瘤潛在相關(guān)的NLR家族分子：NLRP1，NLRP3，NLRP6，NLRP12，NLRC3，NLRC4，NLRC5，NOD1，N

3、OD2，NLRX1以及與NLR家族分子結(jié)構(gòu)功能相似的AIM2分子分析其在10個(gè)已收錄在生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine平臺(tái)的人結(jié)直腸癌腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)水平；2）使用Taqman熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR，分析了這些基因在40例人結(jié)直腸癌和癌旁組織中 mRNA的表達(dá)水平，并分析了它們與炎性小體相關(guān)分子（ASC和Caspase1）以及細(xì)胞因子（IL-1β和IL-18）表達(dá)的相關(guān)性；3）選擇在人結(jié)直腸癌中表達(dá)水平明顯下調(diào)的NLRX1分子，觀測(cè)其在

4、數(shù)據(jù)庫(kù)和40例人結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)，并利用Nlrx1-/-基因敲除小鼠建立三種結(jié)直腸癌模型，全面觀測(cè)NLRX1/Nlrx1在人和小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：1）分析Oncomine上最大、病人信息最全、有237例標(biāo)本的結(jié)直腸癌TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中NLR家族分子和AIM2的表達(dá)趨勢(shì)可以分為三類：重要的炎癥相關(guān)分子 NLRC3和NLRX1，以及可以形成炎性小體的 NLRP1，NLRP3，NLRC4和A

5、IM2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其在正常組織中的表達(dá)水平；而NOD1和NOD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)；但NLRC5、NLRP6以及 NLRP12在結(jié)直腸癌組織和正常組織間的表達(dá)水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2）40例病人組織分析結(jié)果表明NLRC3、NLRP3和NLRX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于其在正常組織中的表達(dá)水平；3）進(jìn)一步分析 Oncomine另外九個(gè)結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步證實(shí)NLRC3、NLRP3和NLRX

6、1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織；4）在三種結(jié)直腸癌模型中，Nlrx1-/-小鼠與正常野生小鼠相比其結(jié)腸組織有大量的炎性息肉產(chǎn)生，同時(shí)NF-κB、MAPK和STAT3活化水平上調(diào)，IL-6的分泌增加。提示由于Nlrx1基因的缺失，導(dǎo)致NF-κB的活化以及結(jié)腸炎性息肉的形成。
　　結(jié)論：1）40例人結(jié)直腸癌標(biāo)本結(jié)合人結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果分析證實(shí) NLRC3、NLRP3和NLRX1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織；

7、2）證實(shí)Nlrx1分子的缺失導(dǎo)致小鼠結(jié)直腸癌病情加劇、進(jìn)展加速，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中可能有潛在的保護(hù)作用。
　　第二部分：DAMP家族CRT分子在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制
　　目的和方法：損傷相關(guān)分子模式（Damage associated molecular patterns，DAMPs）是由死亡的、應(yīng)激的或是損傷的細(xì)胞釋放、分泌或者暴露于細(xì)胞表面的分子，可以為免疫系統(tǒng)提供危險(xiǎn)信號(hào)，進(jìn)而誘發(fā)免疫原性的細(xì)胞死亡（Im

8、munogenic tumor cell death，ICD）。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是DAMPs家族分子的一員。研究表明，CRT在腫瘤細(xì)胞死亡早期，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，是ICD的主要誘因之一。進(jìn)而，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的CRT會(huì)進(jìn)一步被剪切，釋放入血液中，成為潛在的腫瘤標(biāo)志物。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在肝癌患者血清和膀胱癌患者尿液中，可溶型CRT水平顯著增高。肺癌是目前常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尚未見(jiàn)肺癌患者血清中sCRT表達(dá)水平的

9、報(bào)道。因此，檢測(cè)肺癌患者血清中sCRT表達(dá)水平并進(jìn)一步研究CRT在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制是一個(gè)值得深入討論的問(wèn)題。1）我們應(yīng)用此抗原免疫BALB/c小鼠，制備并鑒定小鼠抗人CRT單克隆抗體；2）在此基礎(chǔ)上建立可溶型CRT夾心ELISA檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用此夾心ELISA試劑盒，檢測(cè)正常人和肺癌患者血清中可溶型CRT水平；3）觀測(cè) CRT分子在人肺癌組織中的表達(dá)及其與肺癌病理分型和分化程度的相關(guān)性；4）應(yīng)用肺癌細(xì)胞系初步研究CRT膜

10、轉(zhuǎn)位的機(jī)制。
　　結(jié)果：1）制備并鑒定了26株小鼠抗人CRT單克隆抗體；成功建立了可溶型CRT夾心ELISA試劑盒，其檢測(cè)下限為0.09ng/ml；2）應(yīng)用此 ELISA試劑盒，發(fā)現(xiàn)58例肺癌患者血清中可溶型CRT的表達(dá)水平顯著高于正常人血清中可溶型CRT水平；肺癌鱗癌患者血清中的可溶型 CRT的表達(dá)水平顯著高于腺癌、小細(xì)胞肺癌；3）免疫組化結(jié)果顯示，CRT在肺癌組織上的表達(dá)與肺癌病理類型和分化程度有著明顯的相關(guān)性；4）p38MA

11、PK、ERK、JNK或AKT-PI3K通路抑制劑SB203580、U0126、PD98059或 LY294002及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素（Tunicamycin）或毒胡蘿卜素（Thapsigargin）等藥物，可在不同程度上（12-24小時(shí)）誘導(dǎo)CRT在mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào)，但是流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CRT轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的表達(dá)上調(diào)不明顯。另外，新的藥物BRAF V600e抑制劑PLX4720可在1h內(nèi)使CRT在胞內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，胞膜平均