尿毒癥患者血管鈣化的組織學(xué)研究及相關(guān)分子機(jī)制的探討.pdf

1、第一部分尿毒癥患者橈動(dòng)脈鈣化與α-SMA及OP表達(dá)關(guān)系的研究 目的：觀察尿毒癥患者橈動(dòng)脈鈣化的組織學(xué)特點(diǎn)及平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-SMA)和骨橋蛋白(OP)的表達(dá)變化，并探討影響血管改變的相關(guān)因素。 方法：30例尿毒癥患者，于動(dòng)靜脈內(nèi)瘺術(shù)中取小段橈動(dòng)脈。用VonKossa染色觀察動(dòng)脈鈣化的情況，免疫組化研究中層平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-SMA)和骨橋蛋白(OP)的表達(dá)，并和正常對(duì)照組進(jìn)行比較。 結(jié)果：正常橈動(dòng)脈無(wú)鈣

2、化，平滑肌細(xì)胞排列整齊，免疫組化顯示α-SMA表達(dá)豐富，幾乎無(wú)OP的表達(dá)。在30例尿毒癥患者中，11例(36.67﹪)出現(xiàn)橈動(dòng)脈鈣化，主要局限于平滑肌層，其中6例(20﹪)輕、中度鈣化，5例(16.66﹪)重度鈣化，19例(63.33﹪)未見明顯鈣化。血管鈣化與血鈣、磷及鈣磷乘積水平密切相關(guān)(P＜0.05)，與患者年齡及2型糖尿病史有關(guān)(P＜0.05)，與血肌酐(Cr)、甲狀旁腺激素(PTH)的水平無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。在11例

3、鈣化的血管，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，α-SMA表達(dá)減弱甚至缺失，伴OP表達(dá)量增加，且α-SMA、OP的變化與血管鈣化的嚴(yán)重程度有關(guān)(P＜0.05)。在組織學(xué)尚無(wú)明顯鈣化的19例血管中，有9例可見部分區(qū)域α-SMA水平的降低和OP的沉積。 結(jié)論：尿毒癥患者橈動(dòng)脈鈣化主要發(fā)生在血管中膜，鈣化的嚴(yán)重程度與血磷及鈣磷乘積水平、2型糖尿病史有關(guān)。平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)減少、骨基質(zhì)蛋白OP分泌增多與血管鈣化的關(guān)系密切，說(shuō)明尿毒癥特殊

4、的內(nèi)環(huán)境使平滑肌細(xì)胞失去了原有的生物學(xué)特點(diǎn)，具有類似成骨樣細(xì)胞的功能。 第二部分高磷誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞向類似成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制探討 目的：探討體外高磷培養(yǎng)的條件下，人血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的特點(diǎn)和分子機(jī)制；分析轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)在這一病理過(guò)程中的地位和作用。 方法：(1)用組織塊貼壁的方法建立人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)技

5、術(shù)； (2)用WesternBlot的方法，分別觀察在不同磷濃度(1.0mM，2.5mM，3.5mM)以及TGF-β1(1ng/ml、2ng/ml)刺激的條件下，人血管平滑肌細(xì)胞在不同的培養(yǎng)時(shí)間后，細(xì)胞自身標(biāo)志蛋白α-SMA以及成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白(Ⅰ型膠原、骨橋蛋白和骨鈣素等)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程； (3)通過(guò)免疫熒光觀察上述指標(biāo)以及成骨細(xì)胞特異性的核轉(zhuǎn)錄因子Cbfα1的表達(dá)變化特點(diǎn)； (4)以硝酸銀(VonKoss

6、a)染色和茜素紅染色了解高磷條件下細(xì)胞鈣鹽沉積的狀況； (5)電鏡觀察高磷培養(yǎng)的條件下，鈣化的血管平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)； (6)用WesternBlot和免疫熒光的方法，分析高磷條件下，人血管平滑肌細(xì)胞中TGF-β1的蛋白表達(dá)變化；通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中活性TGF-β1的水平； (7)通過(guò)RT-PCR觀察高磷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞TGF-β1的mRNA表達(dá)影響； (8)用WesternBlot和免疫

7、熒光的方法，分析在高磷的刺激下，細(xì)胞中TGF-β1的Ⅰ型受體(TβRI)的表達(dá)變化； (9)通過(guò)中和抗體阻斷細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的作用，以TβRI、Cbfα1、FN和Ⅰ型膠原為觀察指標(biāo)，分析高磷對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的變化。 結(jié)果：(1)在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，高磷(2.5mM)和TGF-β1(1ng/ml)分別刺激人血管平滑肌細(xì)胞12小時(shí)后，胞內(nèi)Cbfα1的表達(dá)就明顯上升，且迅速?gòu)陌麧{轉(zhuǎn)移到胞核，提示VSMC開始具有

8、類似成骨樣細(xì)胞的生物學(xué)特性； (2)高磷組和TGF-β1組的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)3天后，Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白和骨橋蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)；在含15﹪胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)的第6天，兩組細(xì)胞中骨鈣素的產(chǎn)量開始增加；第12天，用TGF-β1刺激的細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)下降，而高磷組產(chǎn)生類似現(xiàn)象需要15天； (3)在2.5mM的高磷環(huán)境下培養(yǎng)15天后，硝酸銀染色和茜素紅染色顯示，細(xì)胞出現(xiàn)多處斑片狀的鈣鹽沉積；電鏡可見胞漿內(nèi)產(chǎn)生大量

9、膠原纖維和鈣化的基質(zhì)囊泡； (4)在正常無(wú)血清的培養(yǎng)條件下，人血管平滑肌細(xì)胞的上清液中幾乎不含活性TGF-β1，當(dāng)用2.5mM的高磷刺激6小時(shí)后，上清液中TGF-β1的水平增至0.28ng/ml，在隨后觀察的24、48小時(shí)中，TGF-β1的濃度基本保持不變； (5)當(dāng)細(xì)胞在含15﹪胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)3天時(shí)，正常對(duì)照組的上清液中TGF-β1的基礎(chǔ)濃度為0.16ng/ml，而高磷組TGF-β1的含量明顯增加(2.5mM時(shí)

10、為0.35ng/ml，3.5mM時(shí)為0.39ng/ml，與正常對(duì)照組相比，P＜0.05)； (6)WesternBlot和免疫熒光的結(jié)果表明，在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，人血管平滑肌細(xì)胞中僅含極微量TGF-β1，當(dāng)高磷刺激3天后，胞漿中TGF-β1的水平明顯升高； (7)RT-PCR分析顯示，當(dāng)2.5mM的高磷刺激1小時(shí)后，體外無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞中TGF-β1的mRNA水平明顯上升，6小時(shí)后基本達(dá)到高峰，并一直持續(xù)至所觀察的48

11、小時(shí)； (8)Western和免疫熒光的結(jié)果顯示，正常無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，血管平滑肌細(xì)胞僅表達(dá)少量TβRI，當(dāng)2.5mM的高磷刺激3小時(shí)后，細(xì)胞中TβRI的含量開始增加，6小時(shí)后達(dá)到高峰； (9)TGF-β1的中和抗體可明顯抑制高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)變化，如TβRI的表達(dá)上調(diào)、Cbfα1的產(chǎn)生增加和核轉(zhuǎn)移等，并具有抑制細(xì)胞產(chǎn)生FN和Ⅰ型膠原的作用。 結(jié)論：(1)高磷能使體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)成骨

12、細(xì)胞的掌控基因，啟動(dòng)特異性骨相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞自身標(biāo)志性抗原的丟失和細(xì)胞外鈣鹽的沉積； (2)TGF-β1對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞的作用與高磷十分相似，能誘導(dǎo)其向類似成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化； (3)高磷能刺激體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞迅速產(chǎn)生TGF-β1，并上調(diào)其Ⅰ型受體(TβRI)的表達(dá)，表明TGF-β1可能在高磷作用途徑的下游； (4)TGF-β1的中和抗體能明顯拮抗高磷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，提示TGF