豚鼠大腦缺血再灌注后聽(tīng)皮層IRE1、XBP-1的表達(dá)及血液中CRP、IgM的變化.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)以大腦缺血再灌注后的豚鼠為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法觀察IRE1、XBP-1在其聽(tīng)皮層的陽(yáng)性表達(dá)，并利用ELISA法檢測(cè)血液中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、免疫球蛋白M(IgM)的變化，從而研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及血液免疫反應(yīng)在大腦缺血再灌注后聽(tīng)皮層神經(jīng)元凋亡中的作用。
　　 方法:
　　 1、選取健康雄性紅目豚鼠20只，確定雙耳聽(tīng)性腦干反應(yīng)(Auditorybrainstemresponse，ABR)聽(tīng)閾均在10分

2、貝（聲壓級(jí)）(decibelSoundpressurelevel，dBSPL)以內(nèi);將其隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、缺血15min組、再灌注6h組、再灌注24h組及再灌注7d組，每組各4只。后四組在相同條件下采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法來(lái)建立腦缺血再灌注損傷模型術(shù)，對(duì)照組不予手術(shù);缺血15min組術(shù)后馬上行ABR測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)組待再灌注至對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)后行ABR測(cè)試，確定雙耳聽(tīng)力受到影響;每組豚鼠ABR測(cè)試完畢后，均進(jìn)行心臟采血行ELI

3、SA法檢測(cè)，斷頭取腦行免疫組化檢測(cè)。
　　 2、用ELISA法檢測(cè)血液CRP、IgM的濃度。首先對(duì)豚鼠行腹腔注射麻醉，暴露胸腔行心臟灌注前用1ml注射器插入心臟進(jìn)行采血，收集血液后使其充分凝固，置4℃過(guò)夜，離心分離血清，將血清裝于滅菌瓶?jī)?nèi)，貯存于-70℃冰箱;待所有血清標(biāo)本收集完成后，統(tǒng)一包被，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，每孔都加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌，再加入底物顯色，用酶標(biāo)儀在

4、450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。
　　 3、用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定IRE1、XBP-1的表達(dá)。待心臟采血后再心臟灌注生理鹽水，沖凈全身血液;然后換4％多聚甲醛液繼續(xù)灌注至全身上下僵硬，從項(xiàng)部斷頭，剝離頂骨，取出雙側(cè)大腦半球，浸泡于4％多聚甲醛液中24小時(shí)后脫水，透明，浸蠟，包埋，4℃冰箱保存;待所有蠟塊全部收集完成后，統(tǒng)一切片，攤片，烤片，脫蠟，水化，修復(fù)，封閉，加一

5、抗過(guò)夜;次日加二抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)充分顯色后，復(fù)染，脫水，封片;最后在40×10倍的光鏡視野下，用彩色圖像處理軟件對(duì)棕色顆粒陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1、ABR測(cè)試結(jié)果:對(duì)照組為10.0±2.47dBSPL，缺血15min組為20±1.56dBSPL，缺血再灌注6h為30±2.03dBSPL，再灌注24h為30±1.67dBSPL，再灌注7d為15±1.14dBSPL，再

6、灌注6h與24h組比較，無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.01)，其余各兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 2、ELISA法檢測(cè)結(jié)果:CRP(umol/ml)對(duì)照組為1198.96±50.81，缺血15min組為1270.70±34.76，再灌注6h組為1467.80±73.67，再灌注24h組為1352.83±175.71，再灌注7d組為1252.56±41.32。實(shí)驗(yàn)組兩兩之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);IgM對(duì)照

7、組為987.32±39.13，缺血組為1064.90±39.78，再灌注6h組為1118.03±57.75，再灌注24h組為1122.43±55.40，再灌注7d組為1010.70±55.95，再灌注6h與24h組比較，無(wú)顯著差異(P＞0.01)，其余各兩組間均有差異(P＜0.01)。
　　 3、HE染色顯示，各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)目不等，對(duì)照組為2.6±1.13，缺血組為14.1±2.71，再灌注6h組為24.9±2.20，再灌注

8、24h組為19.3±1.46，再灌注7d組為9.4±1.17，實(shí)驗(yàn)組兩兩之間均有顯著差異（P＜0.01）。
　　 4、免疫組化結(jié)果顯示各組IRE1、XBP-1均有顯色。IRE1的陽(yáng)性顆粒數(shù)在對(duì)照組為9.4±1.56，缺血組為25.6±1.58，再灌注6h組為60.3±1.57，再灌注24h組為42.2±2.13，再灌注7d組為18.3±1.59，實(shí)驗(yàn)組兩兩之間均有顯著差異(P＜0.01);XBP-1的陽(yáng)性顆粒數(shù)在對(duì)照組為10.6

9、±1.24，缺血組為24.2±1.52，再灌注6h組為61.4±1.7，再灌注24h組為41.1±2.38，再灌注7d組為18.9±1.59，實(shí)驗(yàn)組兩兩之間均有顯著差異(P＜0.01);
　　 5、IRE1與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析及XBP-1與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析:IRE1與細(xì)胞凋亡率成正相關(guān)(r=0.947，P=0.000)。XBP-1與細(xì)胞凋亡率成正相關(guān)(r=0.933，P=0.000)。
　　 6、CRP與IRE

10、1，細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析:CRP與IRE1成正相關(guān)(r=0.747，P=0.000)。CRP與細(xì)胞凋亡率成正相關(guān)(r=0.755，P=0.000)。
　　 7、IgM與IRE1，細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析:IgM與IRE1成正相關(guān)(r=0.695，P=0.000)。IgM與細(xì)胞凋亡率成正相關(guān)(r=0.765，P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在腦缺血再灌注損傷中，聽(tīng)皮層組織中IRE1α、XBP-1蛋白表達(dá)