大熊貓γ-干擾素基因克隆、原核表達(dá)及真核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、γ-干擾素(IFN-γ)主要是由活化的Thl細(xì)胞、CD<,8><'+>T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，除具有抗病毒和抗腫瘤活性外，免疫調(diào)節(jié)作用是其主要的生物學(xué)功能，如：激活巨噬細(xì)胞、上調(diào)MHCI、Ⅱ類分子表達(dá)水平和促進(jìn)抗原提呈，誘導(dǎo)Th細(xì)胞的分化等，在機(jī)體針對(duì)腫瘤及多種胞內(nèi)病原體感染等疾病的細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的作用，是體現(xiàn)機(jī)體免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是我國(guó)特有的珍稀野生動(dòng)物，被譽(yù)為中

2、國(guó)的“國(guó)寶”。據(jù)國(guó)家林業(yè)總局最新公布的調(diào)查數(shù)字，野生大熊貓現(xiàn)存數(shù)量在1590只左右，人工圈養(yǎng)的大熊貓也僅有189只，它們?nèi)蕴幱诮^滅的邊緣。長(zhǎng)期人工圈養(yǎng)的大熊貓(特別是幼年大熊貓和老齡化大熊貓)大多免疫力低下，抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)感染的能力相對(duì)較弱，對(duì)其疾病的防治目前仍以藥物控制為主，并無(wú)專用疫苗，加上頻繁用藥導(dǎo)致耐藥性菌(蟲(chóng))株出現(xiàn)，以及藥物自身存在的毒副作用，這些都給大熊貓的疾病防治及繁殖工作帶來(lái)了很大的難度。因而為進(jìn)一步搞好大熊貓的

3、飼養(yǎng)管理及疾病控制，就需要研究新的防治技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞因子的作用來(lái)提高大熊貓的自身免疫力將可能是一個(gè)相對(duì)有效的拯救措施之一。 1.本試驗(yàn)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從ConA誘導(dǎo)培養(yǎng)的大熊貓外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增得到大熊貓γ-干擾素基因，并將其克隆到PGEMT載體中。經(jīng)菌落PCR鑒定、序列測(cè)定及序列分析，克隆得到的IFN-γ基因開(kāi)放閱讀框由498個(gè)核苷酸組成，編碼一個(gè)由166個(gè)氨基酸組成的多肽，包括編碼19

4、個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和147個(gè)氨基酸的成熟肽。與Genbank中其他哺乳動(dòng)物的IFN-γ序列比較，它與犬、貓、人、豬、牛、羊、馬、兔、鼠等的核苷酸同源性在57.7％(鼠)～93.2％(犬)之間；IFN-γ編碼氨基酸同源性在46.8％(鼠)～92.8％(犬)之間；進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果表明大熊貓與犬的親緣關(guān)系最近。 2.本試驗(yàn)構(gòu)建了IFN-7基因全編碼序列的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32aIFN-γ，并進(jìn)行了原核表達(dá)研究。將克隆在PGEMT載體中的I

5、FN-γ基因全編碼序列插入原核表達(dá)載體pET32a，得到重組質(zhì)粒pET32aIFN-γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(表達(dá)菌株)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，得到融合表達(dá)蛋白特異條帶，該表達(dá)條帶大小為34.6KDa(IFN-γ成熟蛋白為17.4 KDa，菌蛋白為17.2 KDa)。 3.將克隆在PGEMT載體中的IFN-γ基因全編碼序列經(jīng)EcoRI和XhoI酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收試劑盒

6、回收純化酶切產(chǎn)物，然后與同樣酶切的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒定向連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)IFN-γ，并用酶切分析和序列測(cè)定進(jìn)行了鑒定，結(jié)果酶切分析和序列測(cè)定都證實(shí)真核表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建。本研究成功克隆了大熊貓IFN-γ基因，構(gòu)建了原核和真核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行了原核蛋白的表達(dá)。本研究為了解各物種間干擾素序列的進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究IFN-γ重組蛋白的免疫學(xué)特性和生物學(xué)活性及其應(yīng)用奠定了基